[发明专利]一种高热稳定性的内切木聚糖酶及其应用

说明书

技术领域

本发明属于酶的基因工程领域，涉及一种木聚糖酶，尤其涉及一种高热稳定性的内切木聚糖酶以及生产该高热稳定性内切木聚糖酶的基因工程菌。

背景技术

木聚糖酶(Xylanase,EC.3.2.1.8)是木聚糖降解酶系中最关键的酶，常被用于饲料、食品、饮料、制药、造纸工业和生物能源等方面(Beg,Q.K.Kapoor,M.Mahajan,L.Hoondal,G.S(2001)Microbial xylanases and their industrial applications:a review.Appl Microbiol Biotechnol.56(3-4):326-338)。尤其在造纸工业，木聚糖酶在纸浆的预漂白、二次纤维的脱墨等过程中，水解凝结于纤维表面的半纤维素，提高漂白剂在纸浆中的扩散速度，提高漂白效率，减少氯的使用量，从而减少漂白过程对环境的污染(Liisa Viikari,Anne Kantelinen,Jorma Sundquist,Matti Linko(1994)Xylanases in bleaching:From an idea to the industry.FEMS Microbiology Reviews.13(2-3):335–350)。

目前，研究报道的大多数木聚糖酶的最适温度都在45-55℃，其稳定性都比较差(Haki,G.(2003)Developments in industrially important thermostable enzymes:a review.Bioresour Technol.89(1):17-34)。随着木聚糖酶的不断开发和利用，对酶的稳定性要求越来越高，而现有的商品化木聚糖酶大多数是从中温微生物中获得的，热稳定性差，在60℃以上很容易丧失催化活性，不能满足工业应用的需要。

Dictyoglomus turgidum DSM6724(以下简称D.turgidum DSM 6724)是一株于1990年在俄国堪察加半岛的乌宗火山分离的菌株，是一种嗜高温、厌氧的新型化能自养型微生物，最适生长温度高达80℃(Svetlichnii,V.A.,Svetlichnii,T.P.(1988)Dictyoglomus turgidus sp.nov.,a new extremely thermophilic eubacterium isolated from hot springs of the Uzon volcano caldera.Mikrobiologiya,57:435-441)。其基因组测序已在2008年完成(GenBank accession no.NC_011661).D.turgidum DSM6724能够高效利用多种糖类作为碳源，利用糖基水解酶基因搜索，其基因组中包含54个糖类水解基因(Brumm,P.Hermanson,S.Hochstein,B.Boyum,J.Hermersmann,N.Gowda,K.Mead,D.(2011)Mining Dictyoglomus turgidum for enzymatically active carbohydrases.163(2):205-14)。其中，包含三个木聚糖基因。目前，这些木聚糖酶还没有被研究和利用。本发明涉及其中一个木聚糖酶(GeneID:217966449)基因，即DtXyn11A(以下简称DtX)。由于原始菌株的最适生长温度高达80℃，预测该基因编码的木聚糖酶可能具有良好的热稳定性。

但是利用野生型菌产酶所要求的培养条件苛刻。另外，野生型菌株产酶水平非常低，是细菌的千分之一以下。此外，野生型菌株所产的酶系复杂，无法直接应用，而且目的酶的纯化困难。应用蛋白质工程技术对天然基因进行改造，可以突破自然进化的限制，获得针对工业用途特定设计的、具有优良性质的人工酶基因。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，且又由于在实验中发现重组菌中天然的木聚糖酶DtX表达量很低，而且很难纯化，本发明所要解决的技术问题是改造高热稳定性的木聚糖酶基因，使其在表达系统内高效表达，同时简化目的酶的纯化步骤，并对目的酶进行改造，进一步提高其催化效率与热稳定性，以满足工业应用的需求。

为实现上述目的，本发明提供了一种基因工程木聚糖酶的制备方法，包括以下步骤：

1)构建目的蛋白基因；

2)构建基因工程菌并表达目的蛋白；

3)纯化目的蛋白。