[发明专利]一种沃尼妙林卵黄抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种沃尼妙林抗体的制备方法；特别涉及一种沃尼妙林卵黄抗体的制备方法，属于抗体制备领域。

背景技术

沃尼妙林(Valnemulin，VAL)为新一代截短侧耳类(Pleuromutilin)半合成抗生素，具有安全性较高、抗菌谱广、抗菌活性强、耐药性低等特点而受到广泛关注，目前该药主要用于畜禽支原体及肠道螺旋体感染的预防与治疗。但是由于应用比较广泛，其在动物组织内的残留现象较为严重，可能会引起一些不良反应，此外，沃尼妙林还可以与聚醚类药物作用导致动物中毒。因此，欧洲医药评价局(EMEA)规定，沃尼妙林在猪组织中的最大残留限量(MRL)：肌肉，50μg/kg；肝脏，500μg/kg；肾脏，100μg/kg。

卵黄抗体(Egg yolk antibody)是从免疫禽蛋卵黄中提取的特异性抗体，为禽类所特有，其化学性质稳定，生产制备过程简单、经济，产量高，适合大规模生产。制备卵黄抗体时无需对动物进行采血，便于采集，不会对动物造成损伤，符合现代动物保护要求。但是目前卵黄抗体在兽药残留检测领域应用较少，并且未见沃尼妙林卵黄抗体制备的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种沃尼妙林卵黄抗体的制备方法。

本发明提供一种制备沃尼妙林卵黄抗体的方法，包括如下步骤：通过碳二亚胺将盐酸沃尼妙林与载体蛋白进行偶联，得到免疫原；用免疫原免疫蛋鸡，得到免疫蛋鸡的鸡卵；提取鸡卵卵黄中的沃尼妙林卵黄抗体。

上述方法中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白。

上述任一所述的方法中，所述用免疫原免疫蛋鸡的方法如下：将所述免疫原用等体积的弗氏完全佐剂乳化后首次免疫蛋鸡，再将首次免疫中所用的免疫原剂量减半，并用等体积的弗氏不完全佐剂乳化后对首次免疫的蛋鸡进行加强免疫。

上述任一所述的方法中，所述免疫的方式为背部多点免疫。

上述任一所述的方法中，所述免疫原用PBS溶液溶解；

所述PBS溶液的浓度具体为0.01mol/L。

上述任一所述的方法中，所述首次免疫的所述免疫原的剂量为300-400ug；

所述加强免疫的次数为7-8次，具体为7次；

所述加强免疫具体为在首次免疫后第15天、29天、43天、55天、79天、91天以及121天各进行一次加强免疫。

上述任一所述的方法中，所述提取鸡卵卵黄中的沃尼妙林卵黄抗体的方法为饱和硫酸铵沉淀法，步骤如下：

1)将免疫蛋鸡的鸡卵中的卵黄与纯水混匀，调节pH至5.0-5.2，放置，得溶液1；

2)将溶液1离心，收集上清，加入pH7.2-7.4的饱和(NH₄)₂SO₄水溶液，使饱和(NH₄)₂SO₄水溶液的体积占总体积的30-40％，放置，得溶液2；

3)将溶液2离心，取沉淀即得。

上述任一所述的方法中，所述卵黄和所述纯水的体积比为1:5-6，具体为1:6；

所述放置的条件为4℃-10℃放置12-20h，具体为4℃放置12-20h；

所述饱和(NH₄)₂SO₄水溶液占总体积的体积百分含量为40％；

所述调节pH至5.0-5.2所用的试剂为盐酸。

由上述任一所述的方法制备得到的沃尼妙林抗体也属于本发明的保护范围。

上述沃尼妙林抗体在制备具有结合沃尼妙林的活性的产品中的应用也属于本发明的保护范围；

或，

上述沃尼妙林抗体在制备检测沃尼妙林的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的有益效果在于，利用本发明提供的方法制备的沃尼妙林抗体产量高，在整个试验周期(43周)内收集卵黄抗体的量大约为20g。在免疫后前10周，抗体效价上升速度较快，然后慢慢趋向稳定，抗体效价可在一个较高的水平维持15周以上，并且抗体的最高效价达1：2¹⁸。抗体灵敏度较高，随着免疫的进行，各抗体灵敏度不断提高，所制标准曲线的IC₅₀逐渐下降，并且最低可降至21.77ng/mL。抗体特异性良好，除与泰妙菌素存在383.9％的交叉反应率外，与其它结构相似的抗生素类药物均不存在显著的交叉反应。