[发明专利]梨小食心虫荧光PCR检测方法与应用

权利要求书

1.梨小食心虫实时荧光PCR检测方法，其特征是：

检测中所用特异性引物和探针的核苷酸分别为：

特异性引物为：

F-Primer:5’-CAGCTCTTTTATTACTACTTTCACTACCA-3’

R-Primer:5’-AATAGGATCTCCTCCTCCT-3’；

探针为：

Probe：5’-(FAM)CGAAATCTTAATACTTCATTTTTTGACCCTG(TAMRA)-3’。

2.根据权利要求1所述的梨小食心虫实时荧光PCR检测方法，其特征是包括以下步骤：

①、待鉴定样品基因组DNA的提取；

②、实时荧光定量PCR扩增体系设置：

以基因组DNA为扩增模板，用上述特异性引物和探针，进行实时荧光PCR检测；

③、扩增结果分析及结果判断。

3.根据权利要求2所述的梨小食心虫实时荧光PCR检测方法，其特征是：

探针的5’端标记有报告荧光染料，根据所采用的实时荧光PCR仪的配置而定，所述报告荧光染料为FAM、HEX、JOE、VIC、NED、FITC、CY3或CY5，探针的3’端标记有淬灭荧光染料，所述淬灭荧光染料为TAMRA、ROX、dabcy1、BHQ或ECLIPSE。

4.根据权利要求2或3所述的梨小食心虫实时荧光PCR检测方法，其特征是：

所述步骤②实时荧光定量PCR扩增体系设置为：

25μL总体积中含有10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP(2.5mM，each)2μL，上下游引物(10μM)各0.5μL，探针(10μM)0.5μL，500U Taq DNA聚合酶0.25μL和DNA模板2μL，补水至25μL。

5.根据权利要求4所述的梨小食心虫实时荧光PCR检测方法，其特征是：

实时荧光PCR扩增条件为：95℃预处理15s，再以95℃变性5s，60℃退火/延伸34s，进行40个循环，在每个循环的60℃退火/延伸阶段收集荧光信号。

6.根据权利要求5所述的梨小食心虫实时荧光PCR检测方法，其特征是：

所述步骤④的扩增结果分析及结果判断为：根据样品扩增出具有指数增长型的荧光扩增曲线，当其Ct值小于35，且阴性对照和空白对照无荧光信号，说明该样品受到梨小食心虫污染，否则不是梨小食心虫污染；当检测样品Ct值小于35，但阴性对照/空白对照有荧光信号，说明该检测结果不可信，整个检测过程需要重新做。

7.根据权利要求6所述的梨小食心虫实时荧光PCR检测方法，其特征是：

所述步骤①的梨小食心虫待检样品的DNA的提取可采用CTAB法、SDS法、高盐低pH法或试剂盒法进行提取。