[发明专利]梨小食心虫荧光PCR检测方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种梨小食心虫污染的分子检测方法，具体地说，涉及一种梨小食心虫荧光PCR检测方法，其属于生物技术领域。

背景技术

梨小食心虫(Grapholitha molesta(Busck))属鳞翅目卷蛾科，简称梨小，又名东方果蠹蛾、梨姬食心虫、桃折梢虫、小食心虫、桃折心虫，俗称蛀虫、黑膏药，广泛分布于世界各地，国内遍布个省区，是梨树的重要害虫，在梨、桃树混栽的果园为害尤为严重。幼虫蛀果多从萼洼处蛀入，直接蛀到果心，在蛀孔处有虫粪排出，被害果上有幼虫脱出的脱果孔。幼虫蛀害嫩梢时，多从嫩梢顶端第三叶叶柄基部蛀入，直至髓部，向下蛀食。蛀孔处有少量虫粪排出，蛀孔以上部分易萎蔫干枯。主要寄主除桃和梨外，还有李、杏、苹果、山楂等，既危害果实，也危害新梢，严重影响果品产量和品质。近年来其发生出现上升趋势，是世界性的主要蛀果害虫之一，为出口检疫对象。

梨小食心虫的形态特征，成虫：体长5—7毫米，翅展9—15毫米，全身灰褐色无光泽，触角丝状，下唇须灰褐上翘；前翅灰黑，前缘有7-10组白色短针纹，在翅的中部有一小白点，近外缘处有10个小黑斑点，是其显著特征。幼虫：末龄幼虫体长10～13毫米。全体非骨化部分淡黄白色或粉红色，腹部橙黄，头黄褐色，前胸背板黄白色，透明，体背桃红色。腹足趾钩30～40个。蛹：体长6--7毫米，纺锤形，黄褐色，腹部3～7节背面各具两排短刺，排列整齐，8～10节各生一排稍大刺，腹未有8根钩状臀棘。茧丝质白色，长椭圆形，稍扁平，长约10mm。卵：黄白色，扁椭圆形，中央隆起，周缘扁平，直径0.5～0.8mm，半透明。

梨小食心虫的发生特点：发生世代多，各代发生时期不整，各代发生期很长，世代明显重叠。辽宁、河北、新疆地区1年发生3～4代，河南、安徽、江苏、陕西、山东地区为4～5代，四川5～6代，江西和广西分别为6和7代。以老熟幼虫在果树枝干和根颈裂缝处及土中结成灰白色薄茧越冬，华北第4代多为不完全世代，以3代和部分4代幼虫越冬。翌年春季4月上中旬开始化蛹，越冬部位较分散，树干、主枝分杈、根颈部的粗裂、翘皮下，树下落叶里、草根上和土里都有分布。

苹果蠹蛾(Cydia pomonella L.)，香梨优斑螟(Euzophera pyriella Yang)和梨小食心虫为我国常见的蛀果性害虫，此三种害虫的低龄幼虫在外部形态上非常相似，没有显著差异，目前，我国检疫部门对梨小食心虫的分类鉴定主要是以老熟幼虫或成虫的外部形态特征为依据，在果品出口、运输和实施检疫控制前准确地区分检疫性害虫是相当必要的，目前大多凭借形态学特征只能区分成虫、晚龄期害虫，大多数的检疫性有害生物较短暂的幼虫阶段很难依靠形态学特征精确区分，但苹果蠹蛾、香梨优斑螟和梨小食心虫等有害生物的幼虫基本是在水果采收时大量出现，同时中、外双方截获的食心虫形态特点都不明显，有时以残体形式出现，给种类的鉴定带来很大困难。国外在截获有害生物时，截获检疫性有害生物和截获一般有害生物，对货物处理，产地的制裁，出口的限制有很大的区别。从收到的国外通报看，对方国对截获有害生物的鉴定结果五花八门，我方想对对方结果进行质疑，缺乏有力的证据和方法。检验方法的不成熟和低分辨率依然会造成进口国在截获检疫性有害生物时采取严厉制裁措施的风险。带来过多的技术纠纷，增加禁止出口的风险，增加检疫性处理或者退货会产生较大的费用消耗。因此，建立一种梨小食心虫快速、灵敏、准确的分子生物学检测方法是十分必要和紧迫的，对口岸检疫和防治监测都有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种梨小食心虫实时荧光PCR检测方法，本发明具体给出了用于梨小食心虫实时荧光PCR检测的特异性引物和Taqman探针，本发明能用于有效地从蛀果性害虫(包括梨小食心虫、苹果蠹蛾和香梨优斑螟等)中区分出梨小食心虫。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种梨小食心虫实时荧光PCR检测方法，检测中所用特异性引物和探针的核苷酸分别为：

特异性引物为：

F-Primer:5’-CAGCTCTTTTATTACTACTTTCACTACCA-3’

R-Primer:5’-AATAGGATCTCCTCCTCCT-3’；

探针为：

Probe：5’-(FAM)CGAAATCTTAATACTTCATTTTTTGACCCTG(TAMRA)-3’。