[发明专利]单增李斯特菌 LAMP-LFD检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种用于检测单增李斯特菌的LAMP特异性引物组，其特征在于它是由下述引物组成：

LM-F3   GAAGTAAATTATGATCCTGAAGGTA       SEQ ID NO：1 

LM-B3        GGTAAGTTCCGGTCATCAA       SEQ ID NO：2 

LM-FIP  ATGTGAAATGAGCTAGCTTGCT-CGAAATTGTTCAACATAAAAACTGG    

SEQ ID NO：3 

LM-BIP  TTGCCTGGTAACGCGAGAAA-TACCGTTCTCCACCATTC  

  SEQ ID NO：4；其中LM-FIP的5’端标记生物素。

2.一种用于检测单增李斯特菌的LAMP扩增产物的特异性探针，其特征在于它是由下述基因组成：LM-HP GTTTACGCTAAAGAATGC       SEQ ID NO：5；所述的LM-HP的5’端标记有异硫氰酸荧光素。

3.一种含有权利要求1、2所述用于检测单增李斯特菌 LAMP-LFD特异性引物组和1个特异性探针的检测试剂盒，其特征在于它的组成如下：

（1）LAMP反应液：

 LAMP反应液中含有：2×Buffer（含Mg²⁺） 2.5μL；LM-F3  0.5μL； LM-B3  0.5μL；LM-FIP 0.5μL；LM-BIP 0.5μL；dNTPs 3.5μL

超纯水

Bst酶（8U/μL）  

（4）LM-HP探针 20pmol

（5）横向流动试纸条

（6）用于检测单增李斯特菌的LAMP特异性引物和1个特异性探针；其中的引物和探针指的是：

LM-F3   GAAGTAAATTATGATCCTGAAGGTA       SEQ ID NO：1 

LM-B3        GGTAAGTTCCGGTCATCAA       SEQ ID NO：2 

LM-FIP  ATGTGAAATGAGCTAGCTTGCT-CGAAATTGTTCAACATAAAAACTGG    

SEQ ID NO：3 

LM-BIP  TTGCCTGGTAACGCGAGAAA-TACCGTTCTCCACCATTC    

SEQ ID NO：4

LM-HP GTTTACGCTAAAGAATGC       SEQ ID NO：5；所述的LM-FIP引物和LM-HP探针分别标记有生物素和异硫氰酸荧光素。

4.一种采用权利要求2所述试剂盒用于检测食源性单增李斯特菌的LAMP-LFD方法，其特征在于，按如下的步骤进行：

（1）LAMP扩增反应体系为：2×Buffer（含Mg²⁺） 2.5μL；LM-F3  0.5μL； LM-B3  0.5μL；LM-FIP 0.5μL；LM-BIP 0.5μL； dNTPs 3.5μL；8U/μL  Bst酶lμL；加入样品DNA模板1至5μL；用超纯水补充至终体积25μL

（2） 扩增反应过程： 63 ℃进行60min；

（3）扩增反应结束后不经过终止反应，而在反应体系中加入20pmol的探针LM-HP，63℃杂交5min；杂交结束后，从反应液中取8μL杂交液加入到100μL Buffer 中混匀，将LFD试纸条浸入其中，反应约5分钟读取检测结果；

（4）结果判定：试纸条的质控线和检测线均出现紫红色条带，检测结果为阳性，则说明样品中含有单增李斯特菌；试纸条只有质控线出现紫红色条带，检测结果为阴性；如只有检测线出现条带或不出现任何条带，则检测结果为无效。

5.权利要求1、2所述用于检测单增李斯特菌的LAMP特异性引物组和1个特异性探针在制备用于检测单增李斯特菌 LAMP-LFD试剂盒中的应用。