[发明专利]单增李斯特菌 LAMP-LFD检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于动物卫生和食品检验技术领域，涉及一种用于检测单增李斯特菌菌株的LAMP-LFD试剂盒及其检测方法。

背景技术

单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM），简称单增李斯特菌，是一种重要的人畜共患病的病原菌。该菌属兼性厌氧革兰氏阳性菌，其pH值生长范围为4.39～9.40，在4℃条件下可生长繁殖，因此对冷藏食品的危害性很大。单增李斯特菌广泛存在于各种环境中，极易污染各类食品，据统计，单增李斯特菌主要是通过污染乳制品生奶和软奶酪、畜禽产品、生熟肉制品、蔬菜等，引起食源性李斯特菌病，病死率高达30%。近几年来，因食品污染单增李斯特菌导致的食物中毒事件日渐增多，已引起不少国家的广泛关注。1986年WHO将其列为食品四大致病菌之一，并于2000年在WHO食品安全工作计划中，将该菌列为重点检测的食源性致病菌之一。及时有效地控制食品中单增李斯特菌的污染，是当今食品安全的重要课题之一。因此建立一种快速、准确而又适用于临床的检测方法对于有效诊断单增李斯特菌感染，监测食品污染具有重要的实际应用价值。

对于突发性传染病，快速检测和鉴定病原体是控制疫情的关键。传统的单增李斯特菌诊断主要通过病原分离与生化鉴定完成，但其存在细菌培养操作繁琐、耗时长，不易鉴别相近物种或亚型等缺点。随着分子生物学检测技术的发展，以hlyA基因、inl基因、iap基因等为靶标建立的PCR或实时定量荧光PCR技术已成功应用于单增李斯特菌的实验室诊断，具有特异性强、灵敏度高和速度快等优点，但该方法必须配备昂贵的仪器设备，需专门的操作人员，在适应性上有一定的缺陷。环介导等温扩增技术是Notomi等于2000年建立的，该技术通过针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在等温65℃左右，几十分钟，即可实现核酸的高效扩增。该方法仅需要简单的水浴锅或加热器，操作简便、特异性强、灵敏度高、检测快速，适合于基层及现场使用。

2008年Kiatpathomchai首次将横向流动试纸条技术与环介导等温扩增技术相结合(LAMP-LFD)，用于LAMP扩增产物的检测(Kiatpathomchai et al., 2008)。目前，该方法已被成功用于嗜盐弧菌、人的非洲锥虫病、副溶血霍乱弧菌、桃拉病毒、传染性肌肉坏死病毒、对虾白斑症病毒等病原的检测。在横向流动试纸条技术检测反应中FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，并与胶体金标记的抗FITC的抗体结合形成三元复合物，并结合在横向流动试纸条具有生物素抗体的检测线上；未杂交的FITC标记探针与胶体金标记的抗FITC的抗体形成不含生物素的两元复合物，通过检测线，结合在控制线上。这样可以通过检测带是否显色判断扩增产物的有无。该检测方法依赖于序列之间的特异性扩增，避免了琼脂糖凝胶电泳或荧光染料染色肉眼观察由非特异性扩增造成的假阳性，进一步提高了反应的特异性和灵敏度。并且不需要电泳装置和凝胶成像系统，无需EB等有毒试剂，检测时间短，结果可肉眼观察。因此，LAMP-LFD方法安全、快速、高效且无设备及技术限制，具有其他技术无法替代的优势。

本专利将环介导等温扩增技术（LAMP)）与横向流动试纸条技术（LFD）相结合，针对单增李斯特菌重要的毒力因子hlyA基因设计一套引物和探针，优化反应条件，建立单增李斯特菌LAMP-LFD检测技术。本试剂盒操作简便，作为单增李斯特菌的初筛工具,尤其适用于基层检验检疫机构,为单增李斯特菌的疫情监控和快速检测提供了新的发展方向。

发明内容

本发明的一个目的是提供了一种用于检测单增李斯特菌的LAMP特异性引物组和1个特异性探针，它包括：

LM-F3  GAAGTAAATTATGATCCTGAAGGTA       SEQ ID NO：1 

LM-B3 GGTAAGTTCCGGTCATCAA       SEQ ID NO：2 

LM-FIP  ATGTGAAATGAGCTAGCTTGCT-CGAAATTGTTCAACATAAAAACTGG    SEQ ID NO：3 

LM-BIP  TTGCCTGGTAACGCGAGAAA-TACCGTTCTCCACCATTC    SEQ ID NO：4

LM-HP GTTTACGCTAAAGAATGC       SEQ ID NO：5