[发明专利]一种龙脷叶悬浮细胞培养的快速繁殖方法

说明书

技术领域

本发明涉及龙脷叶悬浮细胞培养的快繁方法，属于生物技术领域。

背景技术

龙脷叶，Sauropus spatulifolius Beille，大戟科，别名：龙舌叶、龙味叶、牛耳叶分布于福建、广东、广西。原产于越南北部，马来半岛有栽培。常绿小灌木，高10-40厘米；茎粗糙；枝条圆柱状，直径2-5毫米，蜿蜒状弯曲，多皱纹；幼时被腺状短柔毛，老渐无毛，节间短，长2-20毫米。具有清肺，治肺热咳嗽，止痰火咳嗽哮喘，治内伤肺痨失音，喉痛的功效，目前主要采用野外采集，悬浮细胞的培养不受地域的影响，既方便又快捷。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是一种龙脷叶悬浮细胞培养的快速繁殖方法，本发明方法所制备的龙脷叶悬浮细胞增殖率高，生长周期短，品质好，以期为工厂化生产提供技术支撑。

为解决上述技术问题，本发明采用下列技术方案：

取龙脷叶幼嫩叶片，在洗衣粉中浸泡15min，流水冲洗15min，超净工作台上0.3%氯化汞处理13min，无菌水冲洗5遍，消毒处理过的叶片接入BEMB+6-BA0.1mg/L+2，4-D1mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加7.5g/L，琼脂30g/L蔗糖，温度23℃，湿度75%，诱导出来的愈伤组织，对其进行C⁺诱变，剂量为1×10¹³ions/cm²，能量为30-50keV，诱变后的愈伤组织，接入BEMB+NAA2mg/L+KT0.2mg/L培养基中进行愈伤组织增殖，附加7.5g/L，琼脂30g/L蔗糖，温度25℃，光照2500lx，湿度85%，增殖后的愈伤组织接入BEMB+NAA2mg/L+KT0.2mg/L培养基中进行悬浮细胞培养，接种量60g/L，温度27℃，水平振荡培养，转速70r/min，培养周期30天。

采用本发明制备的龙脷叶细胞增殖率高，周期短，产量大，污染小，利于大规模种植。

下面将结合具体实施方式对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。

具体实施方式

实施例1

取龙脷叶幼嫩叶片，在洗衣粉中浸泡15min，流水冲洗15min，超净工作台上0.3%氯化汞处理13min，无菌水冲洗5遍，消毒处理过的叶片接入BEMB+6-BA0.1mg/L+2，4-D1mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加7.5g/L，琼脂30g/L蔗糖，温度23℃，湿度75%，诱导出来的愈伤组织，对其进行C⁺诱变，剂量为1×10¹³ions/cm²，能量为30keV，诱变后的愈伤组织，接入BEMB+NAA2mg/L+KT0.2mg/L培养基中进行愈伤组织增殖，附加7.5g/L，琼脂30g/L蔗糖，温度25℃，光照2500lx，湿度85%，增殖后的愈伤组织接入BEMB+NAA2mg/L+KT0.2mg/L培养基中进行悬浮细胞培养，接种量60g/L，温度27℃，水平振荡培养，转速70r/min，培养周期30天，诱变增殖率78%。

实施例2

取龙脷叶幼嫩叶片，在洗衣粉中浸泡15min，流水冲洗15min，超净工作台上0.3%氯化汞处理13min，无菌水冲洗5遍，消毒处理过的叶片接入BEMB+6-BA0.1mg/L+2，4-D1mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加7.5g/L，琼脂30g/L蔗糖，温度23℃，湿度75%，诱导出来的愈伤组织，对其进行C⁺诱变，剂量为1×10¹³ions/cm²，能量为50keV，诱变后的愈伤组织，接入BEMB+NAA2mg/L+KT0.2mg/L培养基中进行愈伤组织增殖，附加7.5g/L，琼脂30g/L蔗糖，温度25℃，光照2500lx，湿度85%，增殖后的愈伤组织接入BEMB+NAA2mg/L+KT0.2mg/L培养基中进行悬浮细胞培养，接种量60g/L，温度27℃，水平振荡培养，转速70r/min，培养周期30天，诱变增值率74%。

实施例3

取龙脷叶幼嫩叶片，在洗衣粉中浸泡15min，流水冲洗15min，超净工作台上0.3%氯化汞处理13min，无菌水冲洗5遍，消毒处理过的叶片接入BEMB+6-BA0.1mg/L+2，4-D1mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加7.5g/L，琼脂30g/L蔗糖，温度23℃，湿度75%，诱导出来的愈伤组织，对其进行C⁺诱变，剂量为1×10¹³ions/cm²，能量为40keV，诱变后的愈伤组织，接入BEMB+NAA2mg/L+KT0.2mg/L培养基中进行愈伤组织增殖，附加7.5g/L，琼脂30g/L蔗糖，温度25℃，光照2500lx，湿度85%，增殖后的愈伤组织接入BEMB+NAA2mg/L+KT0.2mg/L培养基中进行悬浮细胞培养，接种量60g/L，温度27℃，水平振荡培养，转速70r/min，培养周期30天，诱变增殖率77%。