[发明专利]一种卤醇脱卤酶及其在合成他汀类药物中间体中的应用

说明书

本发明公开了一种催化活性高、反应收率高、对环境友好的卤醇脱卤酶，以及使用该卤醇脱卤酶进行取代合成6‑取代‑3,5‑二羟基己酸酯衍生物，进而进一步合成他汀类药物中间体的酶‑化学合成方法。还提供了编码该卤醇脱卤酶的核酸序列，含有该核酸序列的重组表达载体、重组表达转化体及该卤醇脱卤酶的制备方法，以及该卤醇脱卤酶在催化取代反应中的用途。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种卤醇脱卤酶，含有编码该酶的核酸序列的重组表达载体和重组表达转化体，表达的重组酶和该重组酶的制备方法，以及在催化邻-卤醇化合物进行取代反应中的应用。

背景技术

他汀类药物是羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，其通过竞争性抑制内源性胆固醇合成限速酶(HMG-CoA)还原酶，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，使细胞内胆固醇合成减少，从而反馈性刺激细胞膜表面(主要为肝细胞)低密度脂蛋白受体数量和活性增加、使血清胆固醇清除增加、水平降低。他汀类药物还可抑制肝脏合成载脂蛋白B-100，从而减少富含甘油三酯AV、脂蛋白的合成和分泌。因此，他汀类药物在降血脂方面被称为“神奇的药物”。

结构式所示的6-取代-3，5-二羟基己酸酯衍生物是人工合成他汀类药物的重要中间体，如瑞舒伐他汀、阿托伐他汀、普伐他汀、匹伐他汀、氟伐他汀和洛伐他汀等。

制备上述结构式所示化合物的方法主要包括利用氢氰酸或氰酸盐进行化学合成。例如，US6344569B1公开了6-氯代-3，5-二羟基己酸酯与氰化钠在N，N-二甲基甲酰胺中80℃反应生成6-氰基-3，5-二羟基己酸酯的方法。但是，利用化学法均具有收率低下、副产物过多、分离纯化困难等缺点。

因此，近年来，研究的热点集中在生物催化法方面。与化学法相比，生物催化法具有反应条件温和、反应转化率高、产物化学纯度和光学纯度高等优点。目前报道的生物催化酶主要有卤醇脱卤酶。卤醇脱卤酶是一类通过分子内亲核取代机制催化邻卤醇转化为环氧化物的脱卤酶，可以高效高选择性的催化环氧化物和邻卤醇之间的转化，因而可以用来合成具有光学纯的环氧化物，具有传统化学合成法无法比拟的优越性。美国专利US7125693和US7132267公布了Codexis公司对于该项目的研究，以(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯为原料，采用卤醇脱卤酶催化，控制pH为7左右，40℃条件下，在水相中与氰化钠及氢氰酸反应，其中氰化钠与底物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的摩尔比为2.82，合成了(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，化学纯为98％，光学纯为99％，收率为67.13％。后续均是针对上述方法进行改进研究，如江苏阿尔法药业的CN102168117。但是，现有工艺基本都是以4-卤代-3-羟基丁酸酯为原料，氰化物与底物的摩尔比过高，由此带来了严重的工业三废问题，并且反应的路线较长，收率不高，增加了生产成本。

发明内容

针对现有技术中存在的酶用量过高、反应条件不适当、以及反应转化率较低、反应步骤较长等缺点，本发明提供一种催化活性高、反应收率高、对环境友好的卤醇脱卤酶，以及使用该卤醇脱卤酶进行取代合成6-取代-3,5-二羟基己酸酯衍生物，进而进一步合成他汀类药物中间体的酶-化学合成方法。还提供了编码该卤醇脱卤酶的核酸序列，含有该核酸序列的重组表达载体、重组表达转化体及该卤醇脱卤酶的制备方法，以及该卤醇脱卤酶在催化取代反应中的用途。

本发明通过下述技术方案以解决上述技术问题：

本发明的第一方面提供了一种卤醇脱卤酶，其是如下(a)、(b)或(c)的蛋白质：

(a)由SEQ ID No：4所示氨基酸序列组成的蛋白质。

SEQ ID No：4所示的氨基酸序列组成的蛋白质由环境DNA编码，具有取代卤素的功能，是一种新的卤醇脱卤酶。

(b)在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的具有卤醇脱卤酶活性的蛋白质。