[发明专利]监测Hg2＋污染的微生物全细胞发光报告传感器及其制备的试剂盒和应用

说明书

技术领域

本发明公开了一种含抗汞基因启动子和报告基因的微生物全细胞发光报告传感器试剂盒、及生产、使用的方法和用途。 

背景技术

汞是一种具有严重生理毒性的化学物质。由于其具有持久性、易迁移性和高度的生物富集性，使其成为目前全球最引人关注的环境污染物之一。据最新资料统计，目前水、土壤、大气中汞的含量较多年前已经提高了3倍，众所周知，汞污染对人类具有极大的危害。人体无法通过自身的代谢排泄食物链或其它途径累积的微量汞，微量汞累积将直接导致心脏、肝、甲状腺等疾病，甚至导致神经系统紊乱及慢性汞中毒。在工业化工程中，国际上相关地区曾出现过严重的大面积汞中毒事件，并严重影响了当地人民的生命。为此，国际社会对汞的关注程度极高，并提出了极为严格的控制要求，例如，2003年2月欧盟提出的针对中国高达270亿美元的要求新电子和电气设备中确保无汞(Hg)等有害物质，从而要求国内相关企业必须找出应对措施、改进检测方法、提高检测标准，同时质量检测部门必须要提高其对汞元素的监控能力和手段。 

环境中重金属介质的毒性依赖于环境中生物可利用的金属离子的浓度。发光型微生物传感器已被广泛应用于研究检测生物可利用的金属离子。Ralstonia eutropha AE2515已被构建出来，通过将cnrYXH调节基因转录融合到生物发光luxCDABE报告系统来构造出一个完整的细胞传感器用于检测土壤中生物可利用的Ni²⁺和Co²⁺的浓度(Tibazarwa et al.2001)。还有一些光学传感器的工程细菌中包含mer基因的调控区域(merR)和luxCDABE的融合片断，这已被发展用于对Hg²⁺的定量测定。当Hg²⁺结合到merR上时，mer启动子即表示出活性，接着引起lux报告基因的转录，随后发出亮光(Selifonova et al.1993)。土壤中生物可利用的铜离子也可通过荧光假单胞工程菌测出，方法是通过铜离子诱导的基因和含有Tn5::lux启动子转座子探针来实现(Tom-Petersen et al.2004) 

GFP是从多管水母属的Aequorea Victoria中分离出的一种天然荧光蛋白，含有238个氨基酸残基。Aequoria的GFP在395nm能吸收蓝光，受到Ca²⁺或紫外线激活时发绿色荧光，最大发射峰为509nm。GFP的生色团为一个稳定的环状三肽结构，由Ser65、Tyr66和Gly67这3个氨基酸残基通过自身环化和氧化形成，生色团之间是通过共价键结合。野生型GFP的荧光强度较低，细胞质中约1×10⁴个GFP分子发射的荧光才能用普通荧光显微镜精确测定。通过对GFP的结构和生化特性进行改造，已获得许多具有不同激发峰和发射峰的突变体，使GFP荧光强度和作为报告基因的检测灵敏度大大提高。 

由于GFP基因表达产物对细胞没有毒害作用，且由GFP产生的荧光标记检测十分方便简单，被广泛用于科学研究工作中。GFP作为环境微生物的标记基因的优点：(1)荧光特性稳定。只有过热(>65℃)、过酸(pH<4)、过碱(pH为12～13)或其他变性剂存在时GFP的 荧光才会消失。(2)检测极为方便。对GFP的检测仅需蓝光和近紫外光激发，不需要任何外源基质，也不必对细胞进行预处理、固定或染色；用普通荧光显微镜或手提式紫外灯(365nm)照射即可进行观察，使用激光扫描共聚焦显微镜效果更佳，还可以使用细胞分选仪检测。能在现场进行在线检测。(3)GFP的表达与受体细胞的种属无关，原核和真核细胞都能表达，而且对细胞没有毒性，不会扰乱受体细胞的正常功能。(4)能进行单细胞和活细胞观察，也可进行实时原位观测，不会破坏被观察的细胞及其生长环境。(5)土著微生物中不含有GFP，因而检测GFP时一般不会出现假阳性结果。 

通常将GFP作为分子标记。研究表明，可将GFP基因加以改造，去除其多余、调控片断，人为添加调控元件，构建应用于环境监测的报告基因表达系统。另外，GFP基因可用许多载体、以不同方式导入到原核生物细胞内构建报告基因表达系统。如可将GFP基因与质粒构成重组体后导入，还可通过嗜菌体以转导方式转移到宿主细胞中。转移GFP基因的载体除常用的质粒外，还有很多转座子载体，如Min-Mu、Tn系列等。 

目前国内尚未见到有关构建稳定重组merR-Pt启动子和报告基因及它的用途方面的专利和报道。 

发明内容