[发明专利]用N-酰基乙醇胺提高植物种子超低温保藏后存活率的方法及其应用

说明书

技术领域：

本发明属于种子生理及种子储藏技术领域，具体地，涉及用N-酰基乙醇胺提高植物种子超低温保藏后存活率的方法及其应用。

背景技术：

种子保藏是植物种质资源长期保存的重要手段，它可以为农作物新品种选育和品种改良、生态系统修复或重建、植物多样性保护等领域提供重要的实物材料和基因资源。根据联合国世界粮农组织(FAO)最新的统计报告显示，1996年至2009年间，全球各类种子库收集保存的野生植物的种质资源从90万份增加至133.2万份(FAO，2010)。然而，有7-25％的植物(在热带雨林中有高达47％的植物)产生的种子由于不耐脱水，无法通过常规的种子库保存技术进行保存。根据种子的脱水耐性，可以将种子储藏行为分为三种：正常型种子(Orthodox seed)，中间型种子(Intermediate seed)和顽拗型种子(Recalcitrant seed)。正常型种子可以干燥至低含水量(2-5％)而种子活力不受影响，且种子寿命随种子含水量和储存温度的降低而增加。顽拗型种子不耐受过度脱水，通常当种子含水量低于12-31％时就会死亡。中间型种子的脱水耐受性介于以上两种类型之间，但种子在低温时将受到生理上的损失。产生“顽拗型”种子和“中间型”种子的物种大多数属于热带、亚热带森林中的主要建群种或重要经济植物，如龙脑香科(Dipterocarpaceae)、壳斗科(Fagaceae)、樟科(Lauraceae)等。因此，摸索并建立一套新的种质资源保藏体系已经迫在眉睫。

超低温保藏(cryopreservation)是指在液氮温度下(-196℃)保存生物材料的方法。大量实验数据证明，超低温保藏技术是目前实现顽拗型和中间型种子长期保存的唯一的途径(Li and Pritchard2009)，科学家们已经运用超低温保藏技术成功地对咖啡、板栗等在常规种子库无法保存，但却具有重要经济价值的顽拗型和中间型种子建立了一系列成功的保藏体系。虽然超低温保藏技术在种质资源的保藏中已经有成功应用的个例，但由于植物物种的差异，导致每个物种超低温保藏步骤中的处理有区别，而且超低温保藏后物种的存活率及再生率较低，因此，这一技术瓶颈大大制约了对顽拗型和中间型种子以及离体材料的大规模保藏。如何有效地提高物种的存活率是超低温保藏面临的重要问题。

细胞膜是由磷脂双层和相关蛋白以及胆固醇和糖脂组成的围绕细胞或细胞器的通透屏障。细胞膜是最容易受到环境因子胁迫伤害的器官，其损伤可以直接导致细胞死亡。低温是产生细胞膜伤害的胁迫因素之一。植物膜脂主要有8种基本类型约120种分子(molecular species)，包括6种磷脂：磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol,PG)，磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)，磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)，磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)，磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)，磷脂酸(phosphatidic acid,PA)和2种糖脂：单半乳糖二甘油酯(monogalactosyldiacylglycerol,MGDG)，双半乳糖二甘油酯(digalactosyldiacylglycerol,DGDG)。不同类型的膜脂分子结构不同，其生物物理和生物化学性质不同。植物通过调整膜脂组成以适应环境，包括温度的变化。低温导致了细胞膜脂各组成成分发生变化，从而使原本有序的双分子分层排列结构(层状相)，变为紊乱的放射的星状排列的(非层状相)结构(Steponkus et al.,1993)，致使膜的通透性发生改变，细胞液以及大量的无机离子和氨基酸、可溶性糖等小分子被动向细胞外渗漏，破坏了正常的代谢途径，最终导致细胞死亡。PA和MGDG的独特的锥形分子结构，被认为有利于膜损伤的形成(即膜相变中的“非层状相”，Hexagonal II phase)，并最终导致膜渗漏，从而细胞死亡。PA可以由多条代谢途径产生，其中一条重要途径是由磷脂酶D(phospholipase D,PLD)水解磷脂(PC、PE、PG、PS)产生。近年来有越来越多的证据表明，如果外源施加PLDα的特异性抑制剂N-酰基乙醇胺(N-acylethanolamines,NAE),可以抑制PLDα的活性，从而影响PLDα介导的生理过程。NAE是动、植物细胞中一类微量脂质组分，研究发现，PLDα的活性可以被不同的NAE分子抑制(从NAE12:0到NAE18:3的分子均可抑制)，而且这种抑制是PLDα特异性抑制，对于PLD家族中的其他成员(PLDβ和PLDγ)却没有这样的抑制效果(Austin-Brown and Chapman,2002)。