[发明专利]一种水痘病毒抗体检测用抗原片制备方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种水痘病毒抗体检测用抗原片制备方法，用水痘带状疱疹病毒感染细胞至细胞病变后消化制成细胞悬液，再进行抗原片的制备，属于生物技术领域。

背景技术：

目前常用的水痘-带状疱疹病毒抗体检测方法有FAMA法、乳球测定法和ELISA方法。ELISA方法方便快捷适合大规模样本检测，但在实际应用中存在假阴性率过高，不能很好的反应抗体的保护性的缺陷。乳球测定法操作相对复杂，主观性强，适合小量样本检测。FAMA法是目前国际上公认的水痘带状疱疹病毒抗体检测的金标准，具有灵敏度高，特异性强的特点。

传统的FAMA法，各实验室均采用水痘带状疱疹病毒Oka株感染二倍体细胞制备抗原片，因该病毒株感染细胞后，细胞病变的表现形式为带状CPE，故在制备抗原片时，出现病毒在细胞上分散不均，对镜检及判定结果有一定的影响。并且使用传统方法制备的抗原片保存期短，在-20~-70℃保存条件下只能保存一个月左右。抗原片的稳定性和实验结果的可重现性与抗原片的质量和保存时间密切相关，目前尚无文献报道如何延长抗原片的保存时限及抗原片的制备新方法。

发明内容：

本发明提供了一种水痘病毒抗体检测用抗原片制备方法，解决用FAMA法检测水痘抗体中抗原片质量不高及制片过程复杂化问题，同时延长抗原片的保存时间，为批量化制备抗原片提供了条件。

本发明所述的一种水痘病毒抗体检测用抗原片制备方法，其特征在于包括如下步骤：

水痘带状疱疹病毒病毒感染VZV易感细胞，置35℃培养箱培养至病毒复制高峰，经胰蛋白酶消化，进行细胞计数，选择适宜的细胞数量制备病毒细胞悬液，将细胞悬液滴入12孔载玻片上，经35℃培养、清洗、冷丙酮固定干燥后，保存于-20~-70℃。

本发明所述的感染用水痘带状疱疹病毒株优选为水痘带状疱疹病毒VZV 84-7株。

本发明所采用的细胞基质优选为Vero细胞。

本发明所述的生长成单层的细胞密度2.5—3.5×10⁵/ml之间。

本发明所述的用于感染细胞毒种的病毒滴度在4.9-5.2lgPFU/ml之间；感染复数（MOI）为0.01-0.05。

本发明所述的水痘病毒抗体检测用抗原片制备方法，用于感染后细胞消化液的胰蛋白酶使用浓度为0.25%。 

本发明所述的水痘病毒抗体检测用抗原片制备方法，用于制备（FAMA法）抗原片的病毒细胞计数在1.2-1.8×10⁵/ml之间。

本发明所述的水痘病毒抗体检测用抗原片制备方法，抗原片制备过程中，制备病毒细胞悬液无需离心，丙酮固定细胞片后可回收使用。固定后的病毒细胞片无需经PBS浸洗，可直接冻存。

本发明提供一种水痘病毒抗体检测用抗原片制备方法，具体步骤如下：

选择生长至单层的Vero细胞，密度约为2.5—3.5×105/ml；水痘带状疱疹病毒株VZV 84-7病毒滴度为4.9-5.2lgPFU/ml；以感染复数0.01-0.05感染细胞；病毒感染液为含1%谷氨酰胺、2%新生牛血清的MEM，用5.6%NaHCO3调pH值至7.5±0.1；将感染后细胞置35℃恒温培养箱培养至病毒复制高峰；经0.25%胰蛋白酶消化无需离心，进行细胞计数；加入含1%谷氨酰胺5%新生牛血清pH值7.4±0.1的MEM培养液，调节细胞浓度至1.2~1.8×10⁵/ml，制备细胞悬液；将细胞悬液滴入12孔载玻片中，每孔20~25μl，将载玻片置于湿盒中，放35℃、5%CO₂培养箱孵育30分钟后，PBS漂洗1次，自然晾干，直接用冷丙酮室温固定15分钟，取出后，直接放入片盒中，-20℃保存。

本发明的积极效果在于：采用水痘带状疱疹病毒VZV84-7株作为感染毒株制备抗原片，与Oka株感染二倍体细胞相比较，该病毒感染敏感细胞后，其主要特点为该病毒CPE的表现形式散在，广泛的分布在细胞表面；选用Vero细胞作为细胞基质，比二倍体细胞分散的更充分，并且细胞形态更为完整，经感染病毒增殖后，CPE在细胞中广泛出现，用该病毒感染细胞制备抗原片更方便于观察以及对结果进行判定。