[发明专利]一种将外源基因定点整合到靶标基因的方法

权利要求书

1.一种将外源基因定点整合到靶标基因的方法，其特征在于所述方法为：(1)将外源基因扩增后连接至外源基因重组表达载体上，构建重组外源基因载体；(2)将靶标基因跟载体连接，构建重组靶标基因载体；(3)将重组外源基因载体与重组靶标基因载体分别经过AatII和SphI酶切、琼脂糖凝胶回收，获得外源基因-靶标基因片段；(4)以px330质粒为模板，在含T7启动子序列的引物Cas9-F和引物Cas9-R作用下进行PCR反应，将PCR反应产物与pGME-T载体连接，获得质粒pGEM-Cas9，再将质粒pGEM-Cas9经线性化、体外转录及RNA纯化试剂盒回收，获得Cas9mRNA；(5)根据靶标基因序列，人工合成含T7启动子序列的sgRNA，即片段T7-sgRNA，再将片段T7-sgRNA克隆到pGME-T载体，经线性化、体外转录及RNA纯化试剂盒回收，获得T7-sgRNA-靶标基因mRNA；(6)将Cas9mRNA、T7-sgRNA-靶标基因mRNA和外源基因-靶标基因片段混合成混合液，注射哺乳类动物受精卵，实现将外源基因定点整合到靶标基因的目的；

Cas9-F：

5’-TTAATACGACTCACTATAGGATGGACTATAAGGACCACGAC-3’

Cas9-R：5’-GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC-3’。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述每20μl混合液中Cas9mRNA、T7-sgRNA-靶标基因mRNA和外源基因-靶标基因片段的浓度分别为50ng/μl、20ng/μl和10ng/μl。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述外源基因为Cre基因。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述靶标基因为小鼠Enpp1基因。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述哺乳类动物受精卵为小鼠受精卵。

6.如权利要求3～5之一所述的方法，其特征在于所述方法为：(1)重组外源基因载体的构建：以GFP-Cre载体为模板，在引物pCre-F和引物pCre-R的作用下进行PCR反应，回收PCR扩增产物，克隆到pGME-T载体，获得重组外源基因载体pCre-Knockin，核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；

pCre-F:

5’-GAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGTCCAATTTACTGACCGT-3’

pCre-R:5’-ATAAGAGAAGAGGGACAGCT-3’；

(2)重组靶标基因载体的构建：将小鼠Enpp1基因与载体pGEM-T连接，构建重组靶标基因载体pGEM-Enpp1，核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；

(3)外源基因-靶标基因片段：将步骤(1)获得的重组外源基因载体pCre-Knockin和步骤(2)获得的重组靶标基因载体pGEM-Enpp1经酶切后连接，构建载体pCre-Enpp1，核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示；

(4)T7-sgRNA-Enpp1mRNA：根据Enpp1的核苷酸序列，人工合成T7-sgRNA序列，序列为SEQ ID NO.6所示，将SEQ ID NO.6所示的T7-sgRNA序列克隆到pGME-T载体，获得质粒T7-sgRNA-Enpp1，将质粒T7-sgRNA-Enpp1进行线性化、体外转录获得T7-sgRNA-Enpp1mRNA；

(5)以px330质粒为模板，在含T7启动子序列的引物Cas9-F和引物Cas9-R作用下进行PCR反应，将PCR产物与pGME-T载体连接，获得质粒pGEM-Cas9，再将质粒pGEM-Cas9经线性化、体外转录及RNA纯化试剂盒回收，获得Cas9mRNA；

Cas9-F：

5’-TTAATACGACTCACTATAGGATGGACTATAAGGACCACGAC-3’

Cas9-R：5’-GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC-3’；

(6)将T7-sgRNA-Enpp1mRNA、Cas9mRNA与载体pCre-Enpp1混合，然后注射小鼠受精卵，再将受精卵孵育，实现将外源基因Cre定点整合到小鼠Enpp1内的目的。