[发明专利]一种将外源基因定点整合到靶标基因的方法

说明书

(一)技术领域

本发明属于基因工程领域，具体而言，主要涉及外源基因knock-in及过表达载体的构建方法以及依托CRISPR/Cas9技术可将该载体上的外源基因及过表达的目的基因整合到基因组特定位点。

(二)背景技术

近年来，我国医药行业发展很迅速，但是同时也存在着很多问题，例如研发基础薄弱、仿制国外专利泛滥、缺少自主知识产权等等，这些都严重制约着我国的医药行业发展。因此，增强我国的药品研发能力刻不容缓。药物研发过程就是疾病致病机理和药物靶标筛选的过程，筛选的过程大都借助于各类人类疾病的动物疾病模型，特别是与人亲缘关系较近的各类动物模型来分析疾病的发病机制和新型药物的研发。而转基因技术在构建动物模型方面是个很好的工具，可以将目的基因插入到基因组内，在体内正常发挥功能，这为研究疾病的分子机理提供了极其有用的工具。

传统的转基因研究中，将外源基因片段显微注射到受精卵，通过随机插入方式将外源基因整合到机体基因组上；但是随机插入方式会受到位置效应的影响以及载体自身大小限制，不能包含完整的调控原件往往使外源基因的表达水平较低，甚至不表达或异位表达。同时，由于外源基因的多拷贝随机插入到宿主基因组中，这种方式对宿主来说存在一定风险。这些弊端限制了转基因技术的发展。因此，需要一种能使外源基因高效表达，同时具有较高的安全性和可靠性的转基因技术。

为了高效的整合外源基因以及在宿主内正常表达，克服转入基因受到位置效应的影响，研究者们在载体上加入核基质附着元件、位点控制元件、绝缘子等元件以减弱位置效应的影响，但是由于基因表达调控的复杂性，位置效应仍存在影响；同时，外源基因在宿主基因组内仍是以随机方式整合，降低了转基因的安全性及可靠性，这些弊端仍是传统转基因研究急需解决的问题。基因打靶技术的出现克服了传统转基因的弊端，大大提高了转基因的可控性，该技术利用外源基因与基因组序列间的同源性进行同源重组来实现外源基因整合到宿主基因组内的一门技术，具有特异性强、可稳定遗传以及外源基因不受位置效应影响等优点。但是基因重组打靶技术面临重组效率低，构建步骤复杂，同时伴随不正常重组等缺点。因此，急需一种快速、高效、简单整合外源基因的方法。

目前，CRISPR/Cas9系统在基因组编辑方面有着很大的优势，不仅可以定点删除目的基因还可以定点整合目的基因。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种高效定点整合外源基因的方法，以提高外源基因在宿主内正常表达，同时具有安全可靠性，本发明利用CRISPR/Cas9系统将外源基因定点整合到靶标基因，特别是将Cre基因定点整合到小鼠Enpp1基因第一个外显子内，该技术不仅整合效率高(20％)；操作步骤简单，仅需构建一个外源基因载体；同时不存在位置效应影响。利用该技术进行转基因具有独特的优势具有高可控性和安全性，降低了转基因生物的风险。

本发明采用的技术方案是：

一种将外源基因定点整合到哺乳类动物靶标基因的方法，其特征在于所述方法为：(1)将外源基因扩增后连接至外源基因重组表达载体上，构建重组外源基因载体；(2)将靶标基因跟载体连接，构建重组靶标基因载体；(3)将重组外源基因载体与重组靶标基因载体分别经过AatII和SphI酶切、琼脂糖凝胶回收，获得外源基因-靶标基因片段；(4)以px330质粒(Addgene：42230)为模板，在含T7启动子序列的引物Cas9-F和引物Cas9-R作用下进行PCR反应，将PCR反应产物与pGME-T载体连接，获得质粒pGEM-Cas9，再将质粒pGEM-Cas9经线性化、体外转录及RNA纯化试剂盒回收，获得Cas9mRNA；(5)根据靶标基因序列，人工合成含T7启动子序列的sgRNA，即片段T7-sgRNA，再将片段T7-sgRNA克隆到pGME-T载体，经线性化、体外转录及RNA纯化试剂盒回收，获得T7-sgRNA-靶标基因mRNA；(6)将Cas9mRNA、T7-sgRNA-靶标基因mRNA和外源基因-靶标基因片段混合成混合液，注射哺乳类动物受精卵(优选小鼠受精卵)，实现将外源基因定点整合到靶标基因的目的；

Cas9-F：

5’-TTAATACGACTCACTATAGGATGGACTATAAGGACCACGAC-3’

Cas9-R：5’-GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC-3’。

进一步，所述每20μl混合液中Cas9mRNA、T7-sgRNA-靶标基因mRNA和外源基因-靶标基因片段的浓度分别为50ng/μl、20ng/μl和10ng/μl。