[发明专利]有氧下可提升重组蛋白质表现的菌株

说明书

技术领域

本发明关于一种利用基因工程技术建构的菌株，且特别关于一种有氧下可提升重组蛋白质表现的大肠杆菌菌株。

背景技术

细胞内的蛋白质表现为一耗能的生理现象，而消耗的能量大多由细胞摄取、代谢的碳源所供应。因此，若欲提升细胞内重组蛋白质的表现量，细胞须大量摄取并代谢碳源。葡萄糖因容易摄取、代谢，故为这些碳源中最为常见者。

大肠杆菌代谢葡萄糖时，葡萄糖会抑制乳糖、蜜二糖、麦芽糖、与甘油等碳源的穿透酶活性，使菌体无法代谢这类碳源。这过程称为「诱导物排除(inducer exclusion)」。同时，葡萄糖亦会抑制环化酶(adenylyl cyclase)活性，使环化酶无法催化三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)成环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)。环化酶活性的抑制造成菌体内环腺苷酸的含量降低，从而抑制木质糖、阿拉伯糖、鼠李糖、与半乳糖等碳源的穿透酶基因与代谢基因表现，让菌体无法代谢此类碳源。此过程称为「分解代谢物阻抑(catabolite repression)」。

于具T7表现系统(T7expression system)的大肠杆菌内，因分解代谢物阻抑会抑制表现系统的lac基因操纵组的启动子活性，以间接向下调控(down regulate)重组蛋白质的表现量。为解决此问题，J Agric Food Chem.2011；59(12):6534-42已建构一株新颖大肠杆菌菌株，命名为BAD5。阿拉伯糖于有氧下能诱导菌株BAD5表现重组蛋白质。然而，菌株BAD5无法有效代谢葡萄糖以外的碳源，故不能产生足够的能量，以致限制重组蛋白质的表现量。申言之，菌株BAD5的重组蛋白质表现量无法满足业界需求。

发明内容

本发明的第一构想提出一种有氧下可提升重组蛋白质表现的菌株，其属于大肠杆菌，且包含：至少一非内源启动子，为可操作地连接至菌株的染色体上的glpF基因、gldA基因、dhaKLM基因操纵组、及araE基因；一araBAD启动子，为可操作地连接至染色体上的T7RNA聚合酶基因；以及一T7启动子，为可操作地连接至一重组蛋白质基因。而且，菌株缺少araABD基因操纵组、及araFGH基因操纵组。

本发明的第二构想提出一种有氧下可提升重组蛋白质表现的菌株，此属于大肠杆菌，且包含：至少一非内源启动子，为可操作地连接至菌株的染色体上的glpF基因、gldA基因、dhaKLM基因操纵组、araE基因、galP基因、及glk基因；一araBAD启动子，为可操作地连接至染色体上的T7RNA聚合酶基因；以及一T7启动子，为可操作地连接至一重组蛋白质基因。而且，菌株缺少araABD基因操纵组、araFGH基因操纵组、及ptsG基因。

附图说明

图1说明着大肠杆菌的甘油无氧代谢、甘油有氧代谢、及葡萄糖有氧代谢；图中符号说明为：活化基因的表现；抑制基因的表现；

图2为非原态硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺电泳图，以说明菌株生产的可溶性蛋白质；其中，径M，蛋白质标准物；径1，重组菌株BAD5/pChHDT生产的可溶性蛋白质；径2，重组菌株N30/pChHDT生产的可溶性蛋白质；箭头，D-HDT；

图3显示菌株N30的液态培养基于不同时间培养后的葡萄糖与甘油浓度；

图4显示菌株N30-Gal的液态培养基于不同时间培养后的葡萄糖与甘油浓度；

图5为非原态硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺电泳图，以说明菌株生产的蛋白质；其中，径M，蛋白质标准物；径1，重组菌株N30-Gal(φ80-TrHDT)生产的可溶性蛋白质；径2，重组菌株N30(φ80-TrHDT)生产的可溶性蛋白质；径3，重组菌株N30-Gal(φ80-TrHDT)生产的不可溶性蛋白质；径4，重组菌株N30(φ80-TrHDT)生产的不可溶性蛋白质；箭头，融合蛋白质TrxA/D-HDT。

具体实施例