[发明专利]一种抗非洲猪瘟病毒的特异性IgY抗体及制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及动物病毒抗体检测领域，特别是涉及一种抗非洲猪瘟病毒p54蛋白特异性IgY抗体及制备方法和用途。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是猪的一种烈性病毒病，自1909年首次在非洲发现以来，目前已蔓延扩散到整个非洲、欧洲、南美洲和亚洲等国家和地区，发病国家因此蒙受了巨大的经济损失，该病被国际动物卫生组织(OIE)列为重要动物疫病。我国虽然还没有发现非洲猪瘟疫情，但根据周边国家的发病情况，以及2006年以来我国部分省市暴发的猪流行性疫病给我们敲响了警钟，我国已面临ASF传入和流行的严重威胁。

非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus,ASFV)属于非洲猪瘟病毒科，是目前唯一已知的代表种，也是唯一的虫媒DNA病毒。ASFV共有12个蛋白具有抗原表位，分别为p30(CP204L)、p54(E183L)、p72(B646L)、细菌组蛋白样蛋白(A104R)、p10(K78R)、3个非结构蛋白(F334L、K196R和NP419L)和4个未定义的蛋白(B602L、C44L、Cp312R和K205R)，其中针对p54、K205R、A104R和B602L这4种蛋白的抗体滴度较高，维持时间也较长。p54是ASFV重要的结构蛋白，由E183L基因编码，分子质量约为25Ku，具有很好的抗原性，参与病毒中和反应。在弱毒攻毒后7d～10d即可检测到抗体，用该蛋白建立的ELISA抗体检测方法，具有很高的敏感性、特异性和稳定性，是目前综合评价最好的ELISA检测抗原。

鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)作用等同于哺乳动物的IgG，但与其他哺乳动物制备多克隆抗体相比，特异性IgY抗体制备具有抗原用量少、制备周期短、成功率高、动物创伤小、产量大等优势。IgY与IgG相比，其稳定性较强：室温保存适宜温度下可保存较长时间(6个月后中和病毒的活性没有太大的改变)，但浓度较低时(低于0.1mg/mL)放置5个月其活性开始下降，耐高温、耐酸，从而方便IgY抗体的运输和使用。目前纯化的IgY抗体已广泛在免疫沉淀反应、免疫电泳、ELISA、免疫电镜、免疫吸附和Western-blot等检测技术上应用。

非洲猪瘟属于一种外来疫病，目前我国还没有该病的报道，但近邻俄罗斯曾多次发生该病，最近的一次爆发于2014年8月，因此做好实验室技术储备，对于监测和防控该病的传入具有重要作用。目前关于ASFV p54蛋白的研究，主要集中在原核表达和鼠源单克隆抗体的制备以及基于此建立的ELISA方法，还未见特异性抗ASFV p54蛋白的鸡IgY抗体制备的报道。本发明旨在建立抗ASFV-p54蛋白的特异性IgY抗体的制备方法及基于IgY抗体的检测非洲猪瘟抗体的竞争ELISA方法。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种抗ASFV p54蛋白的特异性卵黄免疫球蛋白(抗体)及其制备方法，并进一步提供基于抗ASFV p54蛋白IgY抗体的检测非洲猪瘟血清抗体的竞争ELISA方法。

本发明提供了一种抗非洲猪瘟病毒p54蛋白的特异性IgY抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备非洲猪瘟病毒重组p54抗原，所述p54抗原是用连接有所属重组p54蛋白基因的原核表达载体pET-52b(+)3C/LIC在大肠杆菌BL21(DE3)中表达得到的；

(2)应用(1)所述重组p54抗原免疫产蛋鸡；所述免疫产蛋鸡的方法如下：

第一次免疫：将免疫抗原与等量弗氏完全佐剂乳化,抗原免疫剂量为200μg/只；

第二次免疫：第一次免疫后14d，将免疫抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，抗原免疫剂量为200μg/只；

第三次免疫：第二次免疫后14d，将免疫抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，抗原免疫剂量为200μg/只；

第四次免疫：第三次免疫后30d，直接注射免疫抗原，不使用佐剂，抗原免疫剂量为200μg/只；

(3)收集鸡蛋，分离蛋黄，提取卵黄免疫球蛋白，所述卵黄免疫球蛋白中即含有特异性的抗非洲猪瘟病毒p54蛋白的IgY抗体。

本发明的内容还包括按照上述方法制备的抗非洲猪瘟病毒p54蛋白的特异性IgY抗体。

进一步的，本发明的内容还包括所述的抗非洲猪瘟病毒p54蛋白在检测非洲猪瘟病毒抗体的应用。

具体的，本发明是通过以下技术方案实现的：

(1)抗原制备