[发明专利]一种以柑橘土播实生幼苗为材料的快速转基因方法

权利要求书

1.一种以柑橘土播实生幼苗为材料的快速转基因方法，包括外植体的准备，农杆菌侵染液的准备，实生幼苗的创伤感染，和拟转化芽的分子生物学鉴定，其特征在于直接以土播实生幼苗为外植体。

2.如权利要求1所述的以柑橘土播实生幼苗为材料的快速转基因方法，其特征在于：所述土播实生幼苗的准备包括：选7成熟以上的柑橘果子取种子或用市售的柑橘种子，洗泡后直接播种于温室营养土中促发芽，温室温度为28-30℃。

3.如权利要求1所述的以柑橘土播实生幼苗为材料的快速转基因方法，其特征在于：所述农杆菌侵染液的准备即携带有pFGC5941载体的农杆菌侵染液的制备步骤包括：将农杆菌在含有10-15mg/L Basta的LB培养基上划线，28℃暗培养2天后挑取单克隆涂板，28℃暗培养2天后用液体MS液体培养基洗下菌落，再用不含抗生素的浓度100μM乙酰丁香酮的MS液体培养基28℃震荡培养1-2小时后调OD₆₀₀至0.5-1.0，用于侵染。

4.如权利要求1所述的以柑橘土播实生幼苗为材料的快速转基因方法所述，其特征在于：所述实生幼苗的创伤感染包括：柑橘种子播种后，待实生苗长有2-4片嫩叶时，从第一片叶基部下面切除幼苗的带叶上部，然后用parafilm封口膜紧绕切口部包成一漏斗形，漏斗形上大下小，在漏斗形口滴入农杆菌侵染液，使创伤口浸泡在菌液45分钟到1小时，用滤纸吸干菌液，用漏斗形的parafilm封口膜包压切口保湿，然后用黑膜覆盖暗培养3天后，除去parafilm封口膜，用10-15mg/L Basta溶液擦拭创伤口2-3次，使创伤口处带有Basta溶液，用封口膜包紧创伤口；用黑膜覆盖处理苗10-20天，待发出黄色不定芽时，揭去黑膜，使幼苗及不定芽见光培养生长。

5.如权利要求1所述的以柑橘土播实生幼苗为材料的快速转基因方法所述，其特征在于：所述拟转化芽的分子生物学鉴定包括：实生幼苗经创伤感染步骤后，待拟转化芽长有2-3片时，取部分叶提取DNA，以pFGC5941载体Bar基因引物进行PCR检测，长有5片叶以上时，进行多次PCR复检，获得转基因植株；所述Bar基因引物序列为Bar F：TGC ACC ATC GTC AAC CAC TAC ATC； Bar R：GCT GCC AGA AAC CCA CGT CAT；目标片段433bp。