[发明专利]一种以柑橘土播实生幼苗为材料的快速转基因方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种柑橘的快速转基因方法，具体涉及一种以柑橘土播实生幼苗为材料的快速转基因方法，它主要应用于柑橘类种质创新。

背景技术

柑橘种质创新所应用的转基因方法很多，实验室中主要用根癌农杆菌介导的转化法，所用的外植体很多，有无菌实生菌的上胚轴切段、子叶、成年态茎段及田间成年树腋芽等。利用无菌实生菌上胚切段、子叶切块的遗传转化率频率较高，但外植体需无菌培养，成本也高；成年茎段的出芽率及转化率极低。李卫等发表的《柑桔基因转化新方法的研究》（《植物学报》,1997,39(8):782-784）中是以田间成年树腋为外植体，转化率仅为5.26%，这种方法有离体扩繁鉴定，增加了组培的成本。陈善春等2009年申请了一项专利：一种柑桔的转基因方法（申请号：200910104100.8），这种方法需要准备无菌试管砧木及嫁接苗的制备，增加了准备步骤与成本。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足，提供一种经济、简便、快速且转化率高的以柑橘土播实生幼苗为材料的快速转基因方法。

实现本发明目的技术方案是：

一种以柑橘土播实生幼苗为材料的快速转基因方法，包括外植体的准备，农杆菌侵染液的准备，实生幼苗的创伤感染，和拟转化芽的分子生物学鉴定；所述外植体的准备直接以土播实生幼苗为外植体，即直接以土播实生幼苗为外植体转化出转基因植株。

进一步优化实施地，所述土播实生幼苗的准备包括：选7成熟以上的柑橘果子取种子或用市售的柑橘种子，洗泡后直接播种于温室营养土中促发芽，温室温度为28-30℃。

进一步优化实施地，所述农杆菌侵染液的准备即携带有pFGC5941载体的农杆菌侵染液的制备步骤包括：将农杆菌在含有10-15mg/L Basta的LB培养基上划线，28℃暗培养2天后挑取单克隆涂板，28℃暗培养2天后用液体MS液体培养基洗下菌落，再用不含抗生素含有100μM的乙酰丁香酮的MS液体培养基28℃震荡培养1-2小时后调OD₆₀₀至0.5-1.0，用于侵染。

进一步优化实施地，所述实生幼苗的创伤感染包括：柑橘种子播种后，待实生苗长有2-4片嫩叶时，从第一片叶基部下面切除幼苗的带叶上部，然后用parafilm封口膜紧绕切口部包成一漏斗形，漏斗形上大下小，在漏斗形口滴入农杆菌侵染液，使创伤口浸泡在菌液45分钟到1小时，用滤纸吸干菌液，用漏斗形的parafilm封口膜包压切口保湿，然后用黑膜覆盖暗培养3天后，除去parafilm封口膜，用10-15mg/L Basta溶液擦拭创伤口2-3次，使创伤口处带有Basta溶液，用封口膜包紧创伤口；用黑膜覆盖处理苗10-20天，待发出黄色不定芽时，揭去黑膜，使幼苗及不定芽见光培养生长。

进一步优化实施地，所述拟转化芽的分子生物学鉴定包括：实生幼苗经创伤感染步骤后，待拟转化芽长有2-3片时，取部分叶提取DNA，以pFGC5941载体Bar基因引物进行PCR检测，长有5片叶以上时，进行多次PCR复检，获得转基因植株；所述Bar基因引物序列为Bar F：TGC ACC ATC GTC AAC CAC TAC ATC； Bar R：GCT GCC AGA AAC CCA CGT CAT；目标片段433bp。

    上述方法不需要准备试管砧木苗，不用转接拟转化芽，直接在土播实生幼苗上创伤转化出芽，且在温室中土播种子不受气候与天气影响，也可周年进行，所以本方法操作步骤简便、成本降低、时间更短。本发明还具有如下优点和技术效果：

1、在土播实生幼苗的准备上，种子不用剥皮、不用消毒，直接播到营养土中，生长快、成本低、可周年进行。

2、选生长约1月的实生幼苗为起始材料，这种苗带2-4片嫩叶，叶基部还未木质化，有利于转化；

3、在转化过程中，创伤切口用parafilm封口膜包成漏斗状，在漏斗状开口处滴入农杆菌液，液即不外漏又可与伤口充分接触，可进一步提高转化率。

4、为了提高不定芽的生长速度，对创伤感染后的苗进行遮荫保暗培养10-20天，可使不定芽萌发率达90%以上。