[发明专利]慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P及其构建与应用

权利要求书

1.一种基于Cre-LoxP系统的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P，其特征在于：该慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P是以慢病毒载体pLOX-TERT-riesTK为基础，通过插入多克隆位点构建pLOX-MCS载体，同时在入多克隆位点末端引入由EF1α启动子驱动的EGFP及Puromycin抗性基因片段，进而构建慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P；所述载体pLOX-CMV-E/P所携带的多克隆位点由CMV启动子驱动，所携带的EGFP及Puromycin抗性基因由EF1α启动子驱动。

2.根据权利要求1所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P，其特征在于：

所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P的多克隆位点包括SpeI、BclI、EcoRI、PacI、XhoI、SalI及BamHI酶切位点。

3.根据权利要求1或2所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P，其特征在于：所述的多克隆位点的DNA序列为SEQ ID NO.1所示。

4.权利要求1～3任一项所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P的构建方法，其特征在于包含以下步骤：

(1)设计合成两条引物，分别见SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3；

(2)将上述两条引物等量混合，进行退火反应，以形成DNA双链，进而获得人工合成多克隆位点序列MCS；所述人工合成的MCS两端分别含有SpeI及KpnI酶切位点的粘性末端；

(3)将经过SpeI和KpnI双酶切的pLOX-TERT-iresTK质粒DNA片段，与步骤(2)所述退火形成的MCS片段进行连接，构建pLOX-MCS载体；

(4)设计正向引物EF1α-GFP/Pur-F以及反向引物EF1α-GFP/Pur-R，以pB513质粒为模板，PCR扩增EF1α-EGFP-Puro片段；

(5)将步骤(4)所述的PCR扩增产物及步骤(3)所述的pLOX-MCS载体均使用BamHI和KpnI双酶切，然后进行连接反应，将EF1α-EGFP-Puro片段插入到pLOX-MCS载体多克隆位点中的BamHI与KpnI酶切位点之间，构建成慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：步骤(2)中所述的多克隆位点包括SpeI、BclI、EcoRI、PacI、XhoI、SalI、BamHI、SbfI、MluI及KpnI酶切位点。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：步骤(3)中所述的EF1α-GFP/Pur-F的DNA序列为：5′-CGG GAT CCG AAG GAT CTG CGA TCG CTC C-3′，下划线为BamHI酶切位点，5′端CG为酶切位点保护碱基；所述的EF1α-GFP/Pur-R的DNA序列为：5′-GGG GTA CCT CAG GCA CCG GGC TTG CGG GT-3′，下划线为KpnI酶切位点，5′端GG为酶切位点保护碱基。

7.权利要求1～3任一项所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P在生物技术领域中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：将外源目的基因克隆到权利要求1～3任一项所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P的多克隆位点中，实现外源基因的稳定表达。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：利用权利要求1～3任一项所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P的3′LTR区域已插入的LoxP位点，通过慢病毒载体的转录及反转录过程，最终在外源基因及表达原件整合到宿主基因组中的同时，在其两端同时整合了同向的两个LoxP位点，在Cre重组酶表达的情况下，包含外源基因在内的整合片段将能被有效删除。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：利用权利要求1～3任一项所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P同时表达EGFP及Puromycin抗性基因的特性，不仅能利用EGFP基因进行荧光示踪，同时能利用Puromycin抗性基因进行抗药性筛选；

权利要求1～3任一项所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P与包装载体pCMVR8.74及包膜载体pMD2.G共同转染293T细胞，实现慢病毒颗粒的包装。