[发明专利]慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P及其构建与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P，特别涉及一种不仅适用于Cre-LoxP系统，又携带EF1α启动子驱动的EGFP及Puro双报告基因，同时携带CMV启动子驱动的人工合成的多克隆位点的慢病毒表达载体及其构建与应用。

背景技术

慢病毒载体是以人类免疫缺陷病毒(human immune-deficiency virus,HIV)为基础改造而来，具有宿主范围广，能感染分裂细胞及非分裂细胞，转染效率高，能携带多达8～10kb的外源基因等优势，是基因功能研究及基因治疗领域的重要途径之一。近年来，随着分子生物学技术的深入发展，根据慢病毒载体的物理特性将其分装到几个不同的质粒中，进一步提升了慢病毒载体用于基因治疗的安全性。这种技术改进不但使得慢病毒载体所携带的外源基因有效整合到宿主细胞的基因组并稳定表达，同时又具有较低的免疫原性，进而能有效降低慢病毒载体作为基因治疗手段的潜在风险。而且，与逆转录病毒载体相比，慢病毒载体通过随机整合的方式将外源基因插入到宿主细胞的基因组中，因此不容易造成原癌基因及致癌基因位点的插入突变。目前，基于慢病毒载体的基因转染已经在造血干细胞、NK细胞、DC细胞等免疫细胞中取得成功，从而为有关免疫细胞相关疾病的基因治疗提供了一条有效途径。而且，慢病毒载体系统在肿瘤基因治疗领域同样显示出良好的应用前景。2006年，Levine等进行了第一项基于慢病毒载体的人体临床实验，利用表达靶向HIV的反义基因的慢病毒载体转染T细胞，并回输到患者体内，用于治疗5名经过多个疗程的抗病毒治疗仍然无效的HIV患者。结果表明，其中4名患者体内观察到靶向HIV的细胞免疫，在随后的4年随访中，未发现白血病或其他严重的与基因治疗相关的不良反应，进一步表明了慢病毒载体在临床基因治疗中基本安全。虽然通过慢病毒载体能将外源基因有效整合到靶细胞的基因组中实行稳定表达，但外源基因及慢病毒载体骨架序列的整合对靶细胞仍然存在潜在的安全风险，无法根据需要将外源基因及时删除，急需研发出既能有效筛选、鉴定转染的阳性细胞，又能根据需要有效删除外源基因及载体骨架的更加安全有效的慢病系统。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P。该表达载体既能有效表达外源基因，又能进行荧光示踪及抗药性筛选，而且能利用Cre-LoxP系统进行外源基因有效删除。

本发明的另一目的在于上述慢病毒表达载体的构建方法；

本发明的再一目的在于上述慢病毒表达载体的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基于Cre-LoxP系统的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P，该慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P是以慢病毒载体pLOX-TERT-riesTK为基础，通过插入多克隆位点(MCS)构建pLOX-MCS载体，同时在MCS末端引入由EF1α启动子驱动的EGFP(绿色荧光蛋白)及Puromycin抗性基因(Puro)片段，进而构建慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P；所述载体pLOX-CMV-E/P所携带的多克隆位点由CMV(人巨细胞病毒)启动子驱动，所携带的EGFP(绿色荧光蛋白)及Puromycin抗性基因由EF1α启动子驱动。

所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P的多克隆位点包括SpeI、BclI、EcoRI、PacI、XhoI、SalI及BamHI等7个酶切位点，其DNA序列为：5′-ACT AGT GAT CAG AAT TCT TAA TTA ACT CGA GTC GAC GGA TCC-3′。

所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P的构建方法，包含以下步骤：

(1)设计合成包含SpeI、BclI、EcoRI、PacI、XhoI、SalI、BamHI、SbfI、MluI及KpnI等10个酶切位点DNA序列的两条引物，如下所示：MCS-F：5′-CTA GTG ATC AGA ATT CTT AAT TAA CTC GAG TCG ACG GAT CCT GCA GGA CGC GTG GTA C-3′及MCS-R：5′-CAC GCG TCC TGC AGG ATC CGT CGA CTC GAG TTA ATT AAG AAT TCT GAT CA-3′；