[发明专利]一种用酿酒酵母生产菌丝霉素的方法

权利要求书

1.一种用酿酒酵母生产菌丝霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

改造菌丝霉素基因，合成并扩增菌丝霉素基因，序列见SEQ NO1；利用该改造的基因和启动子Ppgk基因，以及α-信号肽基因构建能够在酵母中表达该菌丝霉素基因的重组质粒；然后用重组质粒转化酿酒酵母；筛选阳性菌株，培养转化菌，最后获得抗菌肽菌丝霉素菌液。

2.根据权利要求1所述的用酿酒酵母生产菌丝霉素的方法，其特征在于，

启动子Ppgk基因，全长793bp，序列见SEQ NO2；α-信号肽基因，全长277bp，序列见SEQ NO3。

3.根据权利要求2所述的用酿酒酵母生产菌丝霉素的方法，其特征在于，

克隆启动子Ppgk基因的过程如下：

以南阳K菌株基因组为模板，设计合成引物扩增启动子Ppgk基因；

引物Ppgk-F1：5’GAG CAC CGG TTA TTT TAG ATT CCT GAC TTC AAC TC3’

引物Ppgk-F2：5’CAG CCA GCT GTG TTT TTA TAT TTG TTG TAA AAA GTAG3’；

PCR反应条件：94℃5min预变性，94℃30s-59℃30s-72℃70s，30个循环，72℃7min；经2％琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化目的片段，保存于-20℃备用；将得到的Ppgk基因与T-载体连接，得到Ppgk-T载体，转化大肠杆菌DH5α菌株，37℃下，用Age I和PvuⅡ双酶切筛选阳性菌株，测序鉴定；

克隆α-信号肽基因的过程如下：

以质粒pPIC9K为模板，设计合成引物扩增α-信号肽基因；

引物α-F1：5’GCGCGGTACCATGAGATTTCCTTCAATTTTTAC3’

引物α-F2：5’TATCAAATGCGGCCGCCGTAAGCTTCAGCCTCTCTTTTC3’；

PCR反应条件：94℃5min预变性，94℃30s-59℃30s-72℃60s，30个循环，72℃7min；经2％琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化目的片段，保存于-20℃备用；将得到的α-信号肽基因与T-载体连接，得到α-信号肽-T载体，转化大肠杆菌DH5α菌株，37℃下，用Kpn I和Not I双酶切筛选阳性菌株，测序鉴定；

克隆改造后的菌丝霉素基因的过程如下：

人工合成改造后菌丝霉素成熟肽的DNA片段并将其保存于PMD19Simple质粒中；再根据其基因序列人工设计合成一对特异引物，以保存于PMD19Simple质粒中的菌丝霉素基因片段为模板通过PCR技术克隆扩增目的基因片段；

引物Plec F1：5’GCG GCC GCA AGA TGG GTT TTG GTT GT3’

引物Plec R1：5’TCT AGA CTT GTC GTC GTC TTA GTA ACA C3’；

PCR反应条件：94℃5min预变性，94℃30s-56℃30s-72℃20s，30个循环，72℃7min；经2％琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化目的片段，保存于-20℃备用；将得到的菌丝霉素基因与T-载体连接，得到Plec-T载体，转化大肠杆菌DH5α菌株，37℃下，用Not I和Xbal I双酶切筛选阳性菌株，测序鉴定。