[发明专利]一种用酿酒酵母生产菌丝霉素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种用酿酒酵母生产菌丝霉素的方法。

背景技术

中国是畜牧养殖大国，每年生产的动物饲料达1亿吨以上，而在存放过程中因饲料腐败变质引起的损失超过10亿元。目前解决这一问题普遍采用的措施是在饲料中添加化学防腐剂，但残留在动物机体内的化学防腐剂不仅影响了畜禽产品的质量，还威胁到人们的身体健康，如引发肠胃炎等疾病，影响肝、肾功能等。另一方面，由于在我国动物饲料中长期大量地添加抗生素，严重影响动物消化道微生态平衡，造成一些病原菌耐药性的发生，使得针对由这些病原菌所引起的感染所进行的预防和治疗变得非常困难。因此，替代化学防腐剂和抗生素在动物养殖中的使用，真正实现畜牧业的和谐、健康发展是我国畜牧养殖业急需攻克的难题。

传统的抗生素是通过与微生物特定部位的受体结合，从而破坏微生物的正常结构或阻断酶的活性及必要的代谢途径等来实现抑菌或杀菌的作用。微生物的靶位点发生简单的基因突变就可对付抗生素的攻击，从而产生耐药性。与传统抗生素相比，微生物对抗菌肽产生耐药性的过程则要困难很多。这是因为抗菌肽的主要作用机理是通过与细胞膜上的氨基酸相互作用，以此穿透细胞膜、扼杀细菌，所以细菌必须改变膜的表面结构，即改变相当部分的基因，才能对付抗菌肽的攻击，而这几乎是不可能的。抗菌肽的另一个突出优点是抗菌谱广，传统抗生素只针对某一类细菌具有抗性，而抗菌肽通常对G+和G-菌均具有抗性。此外，抗生素的残留问题越来越受到广泛的重视，而抗菌肽是一种小分子多肽，在动物的消化道内可以被降解为氨基酸，因而不存在残留的问题。在国外，已有多种成熟的抗菌肽产品在临床医疗中应用，而且取得了较好的效果。例如，来自两栖动物的抗菌肽马盖宁(magainin)，已被用于某些感染性疾病的临床治疗；来自微生物的抗菌肽乳链菌素(nisin)，已被美国FDA批准为血液防腐剂添加成分。我国在抗菌肽的研究方面还处于探索阶段，在关键技术上还不成熟。抗生素残留已经成为我国畜产品走向国际市场的最大障碍之一，因此发展具有自主知识产权的新型抗菌肽产品来替代化学防腐剂和抗生素的使用，对于我国畜牧业的安全、健康、和谐发展具有重要意义。

菌丝霉素是丹麦生物技术公司在2005年从腐生子囊菌的分泌蛋白中分离出的首例真菌防御素。防御素是存在于动物和高等植物中的一类富含半胱氨酸的天然抗菌肽，它们对多种微生物均具有较强的防御能力，因此，防御素是目前颇具吸引力的一类新型候选抗菌药物。菌丝霉素的成熟功能片段只有40个氨基酸，其分子量约为4.4KDa，其空间结构由一个α-螺旋和两个反向平行的β-折叠组成是典型的防御素CSαβ结构。其生物学活性主要表现为对革兰氏阳性菌有较强的杀菌作用，尤其是对肺炎链球菌、脓性链球菌、金黄色葡萄球菌等，菌丝霉素的抗菌方式类似于现在广泛使用的万古霉素。此外，菌丝霉素在体外抑菌试验、动物试验及一些临床试验中表现出无细胞毒性、无溶血性、脑脊液渗透性好等优势，且能有效治疗由肺炎链球菌引起的实验腹膜炎、肺炎小鼠，亦能有效杀灭对传统抗生素有抵抗力的一些菌种，对引发肺炎、脑膜炎和链球菌性扁桃体炎的肺炎球菌也有疗效，不产生耐药性，与传统使用的抗生素之间不存在交叉抗性，因此作为新一代抗生素替代品具有巨大的发展潜力。

现有的菌丝霉素表达系统目前有以下几个来源，1)从腐生子囊菌的分泌蛋白中分离得到，但是含量很低且难以分离纯化；2)化学合成生产菌丝霉素周期短，但该方法成本高昂；3)通过基因工程手段获得，主要是采用原核表达和真核表达系统。其中原核表达系统虽表达量高、生长周期短，但其翻译后加工修饰体系不完善，表达产物活性低，且分离纯化产物难度大。目前采用的真核表达系统大多都是甲醇营养型毕赤酵母，该方法能够高密度发酵，但仍存在以下不足之处：抑菌效果有限；发酵周期长；发酵过程中必须添加大量甲醇诱导表达，而甲醇易燃易爆且有毒，存在一定的危险性；发酵成本高，影响因素多；所以目前的培养基和培养条件都还不成熟。

发明内容

本发明为了克服现有技术存在的不足，如分离纯化难度大，生产周期长、成本高，残留甲醇带来的危害，以及产物活性低等缺陷，提供一种利用酿酒酵母表达抗菌肽菌丝霉素的方法。

一种用酿酒酵母生产菌丝霉素的方法，包括以下步骤：

合成并扩增菌丝霉素基因，序列见SEQ NO1；利用该基因和启动子Ppgk基因，以及α-信号肽基因构建能够在酵母中表达该菌丝霉素基因的重组质粒；然后用重组质粒转化酿酒酵母；筛选阳性菌株，培养转化菌，最后获得抗菌肽菌丝霉素菌液。