[发明专利]一种能够快速区分猪圆环病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)的多重PCR诊断方法和专用试剂盒

说明书

技术领域

本发明专利涉及兽医生物技术领域的诊断技术，具体是一种能够快速区分猪圆环病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)的多重PCR诊断方法和专用试剂盒。

背景技术

猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)是一种小的、二十面体对称、无囊膜、单股环状DNA病毒。病毒粒子直径为17nm左右，是目前发现的最小DNA的动物病毒之一。圆环病毒有两个基因型：无致病性的PCV1和具有致病性的PCV2。猪圆环病毒2型也是引起断奶仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)的主要病原，该病主要表现为体重下降，呼吸困难，黄疸以及间质性肺炎，淋巴结肿大，肝炎和肾炎等症状，给养殖业带来巨大的经济损失，是目前危害世界养猪业的重要疫病之一。猪圆环病毒1型虽然没有致病性，但经常污染猪源的细胞系，而且在实验室的PCV2细胞毒培养纯化中很容易污染PK-15细胞，影响PCV2的增值。本研究的目的是建立一种能够快速区分猪圆环病毒1型和2型的多重PCR诊断方法和专用试剂盒，方便实验室对细胞培养及PCV2细胞毒纯化的随时监控。

发明内容

本发明的目的是针对目前我国PCV2感染普遍存在，给养猪业带来严重经济损失，而PCV2培养过程中经常污染PCV1的现状，提供一种能够方便实验室对细胞培养及PCV2细胞毒纯化进行随时监控的诊断方法和专用试剂盒。

本发明的目的是这样实现的：

自行设计特异性引物，提取细胞等病料DNA，在此基础上利用PCR方法检测猪圆环病毒1型和2型，并在此基础上研制成功了专用试剂盒，与现有技术相比该诊断方法和专用试剂盒具有很强的特异性、敏感性，与病毒分离和IFA等方法相比符合率可达90％以上，可广泛用于猪圆环病毒1型和2型的鉴别检测。

附图说明

图1试剂盒对PCV1和PCV2特异性鉴别扩增结果

M：DL2000(2000，1000，750，500，250，100bp)；1、3泳道：特异性扩增PCV1目的条带；2泳道：特异性扩增PCV2目的条带；4泳道：阴性对照

图2临床样本的PCR检测结果

M：DL2000(2000，1000，750，500，250，100bp)；1、2、3、6、8、9、13：PCV1阳性检测样本；4、5、7、10、11、12：PCV2阳性检测样本；14：PCV1、PCV2阳性检测样本。

具体实施方式

1.1引物设计：根据NCBI上发表的PCV1和PCV2基因序列的差异，设计了三条特异性引物L1、L2、L3，扩增猪圆环病毒II型(PCV2)预计扩增片段大小为404bp，扩增猪圆环病毒I型(PCV1)预计扩增片断大小为198bp。

L1：5′-TATTACCGGCGCACTTCGGCAGCG-3′

L2：5′-TCACTCCGTTGTCCCTGAGATCT-3′

L3：5′-TCTTCCAAACCTTCCTCTCCGCAA-3′

其中L1和L2能够特异性扩增猪圆环病毒II型(PCV2)，预计扩增片段大小为404bp，L1和L3扩增猪圆环病毒I型(PCV1)预计扩增片断大小为198bp，退火温度为55℃，采用30个循环。

1.2病毒DNA的提取

分别取PCV1和PCV2细胞培养裂解液，反复冻融3次后，5000g离心15分钟。

1)取上清500μL于1.5mL离心管中，加入50μg/mL的蛋白酶K 5μL，加入10％的SDS溶液25μL，55℃水浴2～3小时。

2)加入200μL Tris饱和酚，充分混匀，10000g离心15分钟。

3)取上清于一新离心管中，加入Tris饱和酚和氯仿各200μL，充分混匀后，10000g离心15分钟。4)取上清于一新离心管中，加入200μL氯仿，充分混匀，10000g离心15分钟。

5)取上清于一新离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃静置20分钟，10000g离心15分钟，弃上清。

6)加入70％的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。

7)加入20μL灭菌超纯水溶解沉淀，-20℃保存备用。

1.3聚合酶链式反应(PCR)

以上述DNA为模板，按顺序加入以下试剂，建立50μLPCR反应体系