[发明专利]一种用于检测诺卡氏菌的核苷酸序列及应用

说明书

技术领域

本发明涉及TaqMan探针在细菌检测中的应用，特别是诺卡氏菌鉴别诊断中的应用，属于分子生物学和微生物学领域。

背景技术

诺卡氏菌(Nocardiaceae)是一种需氧的革兰氏阳性棒状杆菌，1890年Eppinger报道了由诺卡菌引起的第一例人类感染病例，它引起的诺卡菌病是一种急性或慢性化脓性或肉芽肿性的病变。免疫力低下的人群最易感染，主要引起肺部疾病、皮肤性疾病以及全身播散性疾病，临床病症复杂多样，主要有菌血症、积脓症、心包炎、感染性心内膜炎等，严重时甚至能够引起病人的死亡。诺卡氏菌是条件致病菌，内源性感染的几率较小，很少发生人传人的现象。根据国内外的报道，目前至少有6种诺卡氏菌能够同时感染人与动物，研究学者通过大量的调查研究发现诺卡氏菌病的感染几率正在逐年增加，而且诺卡氏菌经常会侵袭脑部，形成脓肿，造成致死性感染，传统的鉴定诺卡氏菌的方法如分离培养、表型鉴定等较为费时费力，易延误病情，难以满足目前的临床诊断需求。

实时荧光TaqMan PCR技术(real time TaqMan PCR，TaqMan是罗氏公司(Roche Molecular System,Inc.)的注册商标)最近几年广泛应用于病原体微生物的检测，普通PCR方法只能将产物从大小上进行区分，实时荧光TaqMan PCR技术在普通PCR的基础上又加入一条特异的荧光探针，并且该技术对引物与模板的同源性要求也高于普通PCR。实时荧光TaqMan PCR中的探针序列必须与目标序列完全匹配，荧光基团连接在探针的5'末端，而淬灭剂则在3'末端。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；但在PCR扩增时，随着引物的延伸Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此比普通PCR法具有更高的特异性。但是在荧光TaqMan PCR技术的应用中，探针的选择是一个重要因素，因为其涉及到与引物的匹配，以及最关键的检测特异性的问题。本发明旨在应用实时荧光TaqManPCR技术，建立一种针对诺卡氏菌的灵敏、特异、快速的核酸检测体系，用于模临床标本的检测

发明内容

本发明的目的在于提供一种应用能够应用于细菌检测，特别是荧光TaqMan PCR技术的检测探针序列，更进一步提供于荧光TaqMan PCR技术检测诺卡氏菌方法，以及用于该方法的试剂盒。

基于上述目的，本发明首先提供了一种用于细菌检测的探针序列，所述序列含有如SEQ ID NO:3所示的序列。

其次，本发明提供了一种用于非诊断目的的荧光TaqMan PCR检测方法，所述方法包括：

(1)被检测物种的基因组DNA的抽提；

(2)以步骤(1)获得的DNA为模板进行TaqMan PCR扩增，其中上游引物为SEQ ID NO:1所示的序列，下游引物为SEQ ID NO:2所示的序列，探针序列为SEQ ID NO:3所示的序列；

(3)对扩增结果进行检测分析。

在本发明一个优选实施方案中，所述步骤(2)的PCR反应条件为：

在另一个优选实施方案中，所述步骤(2)和(3)在ABI7500Fast实时荧光定量PCR仪中进行。

优选地，所述物种为细菌。

更为优选地，所述细菌选自下述细菌：诺卡氏菌、嗜肺军团菌、肺炎克雷伯、肺炎链球菌、百日咳杆菌、分枝杆菌、小肠耶尔森菌、艰难梭菌。

最为优选地，所述细菌为诺卡氏菌。

本发明提供的检测方法的结果判断方法为：(1)若样品有明显的S型扩增，且Ct值≤34，则判定样品为诺卡氏菌阳性；(2)若有S型扩增，且34<Ct≤40，判定为不确定样品，需重新提取核酸检测；若复检的样品仍有S型扩增，且Ct<40，则判定为诺卡氏菌阳性，否则为阴性；(3)若无明显的S型扩增曲线，但报告仍有荧光值、Ct值，为非特异性扩增，可能为探针降解所释放的非特异性荧光信号。

最后，本发明还提供了一种用于细菌检测的TaqMan PCR试剂盒，所述试剂盒包括：

(1)热启动Taq DNA聚合酶；

(2)实时荧光定量PCR缓冲液；

(3)序列为SEQ ID NO:1的上游引物为和序列为SEQ ID NO:2的下游引物；

(4)序列为SEQ ID NO:3的探针。