[发明专利]一种人源溶菌酶蛋白纯化方法

说明书

本发明属于蛋白纯化领域，具体而言，本发明涉及一种纯化人源溶菌酶蛋白的方法。本发明还涉及该生产方法的应用。本发明提供了一种人源溶菌酶蛋白纯化方法，该人源溶菌酶蛋白纯化方法包括：发酵液的前处理；Bestarose MMC Diamond捕获；Bestdex G‑25缓冲液置换；浓缩目的蛋白。本发明建立了复合型阳离子交换介质分离纯化发酵液中人源溶菌酶的新工艺，步骤少、成本低，能得到较高的蛋白投入产出比，为人溶菌酶蛋白的工业化生产提供了一个高效的生产工艺。

技术领域

本发明属于蛋白纯化领域，具体而言，本发明涉及一种纯化人源溶菌酶蛋白的方法。本发明还涉及该生产方法的应用。

背景技术

随着生物技术的发展，获得蛋白的方法越来越多，经典的蛋白质分离纯化过程通常包括以下步骤：(1)破碎生物组织，用适当的缓冲液将蛋白质抽提出来；(2)用离心法将细胞的亚细胞颗粒(如细胞核、线粒体、微粒体或核糖体等及细胞碎片去除；(3)应用盐析法或有机溶剂法将有关蛋白质组分沉淀下来；(4)进一步应用层析法或电泳使各种蛋白质分开；(5)如果用可能的话，将蛋白质结晶或制成冻干粉。

用该方法获得人源蛋白需考虑以下问题：第一，人组织来源少，而目的蛋白含量高、活性高可溶性稳定性好的组织来源就更少了；第二，每个分离纯化的步骤都会损失一定量的蛋白及蛋白活性，但是分离步骤太少又不能达到一定的纯度；第三，每个分离纯化的步骤中所用的试剂及相关参数对不同的蛋白的适用范围都是不同的；第四，不同蛋白的精确定性定量通常需要特定的方法。

随着生物化学的发展，肽的人工合成已成为可能，然而这种方法只适合于合成含有十几个氨基酸残基的小蛋白，况且化学仪器中合成的蛋白是否与天然存在的蛋白具有一致的构象与功能还有待于进一步研究。

目前，运用基因工程技术也可以在大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物等多种表达体系中高效表达，但是这种生产蛋白的方法同样涉及到分离纯化的问题。

溶菌酶是分解粘多糖的多肽类免疫抗菌分子。它具有耐热、耐酸的理化特性，可溶于水、乙醇、油脂类溶剂，通过裂解细胞壁而达到裂解革兰氏阳性细菌的效果。对溶菌酶杀菌能力研究表明：极微量的溶菌酶即可杀灭溶壁微球菌、藤黄球菌、巨大芽孢杆菌、棒状杆菌、乳酸杆菌、细球菌、八迭球菌、葡萄球菌等自然界常见细菌。目前市场上的溶菌酶都是来源于其他种属动物机体，对人体而言是异体蛋白，有很强的抗原性，副作用大。

天然人溶菌酶主要存在于人乳汁、唾液、眼泪、胎盘等分泌物和器官中，由于来源受限且不易提取，所以价格昂贵。目前，科研人员已利用化学合成法或从人类细胞组织中制备cDNA等途径获得人溶菌酶基因，一些已经在真菌、细菌、动物反应器等体系中得到表达，但是产量非常有限，不能满足其在食品、医药、畜牧等行业的广泛应用。

目前，分离纯化工艺的建立一般都经过实验室研究、中间试验生产到工业规模生产线的放大过程。毕赤酵母在表达重组人溶菌酶的过程中会产生色素物质，使发酵液呈黄绿色，同时还会产生杂蛋白、核酸等杂质，因此需要对发酵液进行纯化处理，才能用于后续研究。目前关于溶菌酶的分离纯化方法，主要有结晶法、离子交换法和亲和色谱法。结晶法是最传统的制备溶菌酶的方法，主要是根据溶液条件，使溶菌酶以结晶态析出，该方法操作简便，成本很低，但是产率偏低，很难获得高纯度产品；以亲和为基础的分离技术存在处理量比较小，亲和介质价格昂贵的弊端；离子交换法是最常用的提纯方法，该方法是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异从而分离出目的蛋白，简便、高效、可自动化连续操作，但现存的问题是，发酵液为无机盐培养基，离子浓度很高，上样前需对发酵液进行稀释以降低离子强度，否则色谱柱填料刚性小，及易被堵塞，造成再生使用的麻烦，造成了分离速度和效率低下。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种操作简便、成本低廉、产品纯度高的人溶菌酶纯化方法，以达到工艺周期短、收率高，易于线性放大至生产规模的目的。