[发明专利]一种制备荧光单标记的眼镜蛇神经毒素的方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种制备荧光单标记的眼镜蛇神经毒素的方法，尤其是一种半制备液相色谱制备荧光单标记FITC的眼镜蛇神经毒素的方法。

(二)背景技术

眼镜蛇神经毒素(Neurotoxin，NT)——一种水溶性大分子多肽，是从中华眼镜蛇毒液中分离的一类短链神经毒素，由62个氨基酸残基组成,其结构中含3个赖氨酸残基。在长久的中医药临床实践中发现，中药蛇毒具有良好的镇痛作用。中医认为：蛇毒可通经络、祛风湿，具有强身健体之功效。现代医学研究表明，蛇毒不仅镇痛效果明显，而且无胃肠道不良反应，无耐受性和成瘾性，其效价强度比同等剂量的吗啡高数十倍，且镇痛效果比吗啡持久，是一种新型的替代性镇痛药物。现已有肌内注射剂上市，主要用于治疗癌痛和各种慢性、顽固性疼痛等。神经毒素临床给药剂量较小，毒性大，主要作用于中枢，但其作用机制目前尚未能完全阐明。

近年来，随着对NT的研究不断深入，越来越多的实验研究需要对NT进行标记示踪，且其微量定量测定方法的建立遇到较大困难。蛋白多肽类药物的体内分析多采用放射性同位素及荧光素标记。相对于放射性同位素在非啮齿类动物(如犬等)研究中的高成本、高污染，荧光素的使用更低廉、安全，且对人体和环境的危害小。异硫氰酸酯(fluorescein isothiocyanate，FITC)是一种常用的阳离子荧光标记物，其标记原理主要是与生物大分子上的NH₂-基团结合，本发明中，FITC能与眼镜蛇神经毒素肽链上的赖氨酸残基和N端的氨基发生反应，形成硫脲键，涉及的反应如下式所示：

有报道显示，异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记与¹²⁵I标记示踪法一致性高，FITC荧光素可作为放射性同位素¹²⁵I的替代标记探针，用于实验动物体内的定量分析。FITC标记高效液相色谱法由于NT结构中含有多个FITC可标记位点，而导致标记产物可能为多标记混合物，故其应用受到限制。

(三)发明内容

本发明目的是克服上述现有方法存在的缺陷，为尽量减小标记物对药物性质及实验人员的影响，提供一种FITC荧光单标记的眼镜蛇神经毒素(FITC-NT)的制备方法。

本发明采用的技术方案是：

一种制备荧光单标记的眼镜蛇神经毒素的方法，所述方法包括：以硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)为衍生剂，眼镜蛇神经毒素(Neurotoxin，NT)与硫氰酸荧光素摩尔用量之比为1:1-1.2，于20-40℃下、在pH为8.4-8.6的硼酸缓冲液中进行衍生化反应8-10h，反应液经分离纯化得到荧光单标记的眼镜蛇神经毒素。

具体的，所述反应液分离纯化采用半制备液相色谱分离，色谱条件为：采用反向菲罗门Jupiter 5u C18300A(10.0×250mm)色谱柱；流动相：流动相A为质量浓度为0.1％的TFA水溶液，流动相B为质量浓度为0.1％的TFA乙腈溶液，以3mL·min^-1流速进行梯度洗脱；色谱仪上装有荧光检测器，荧光检测激发波长为445nm，发射波长为525nm；进样量为200μL；柱温为35℃。

具体的，梯度洗脱参数如下：0min，5％(v/v，B占A+B体积百分比)B；15-30min，23％B；35min，90％B；40min，90％B；42min，5％B。

优选的，所述衍生化步骤如下：取眼镜蛇神经毒素和硫氰酸荧光素分别溶于适量的pH 8.4的硼酸缓冲液和丙酮中，眼镜蛇神经毒素与硫氰酸荧光素摩尔用量之比为1:1，在室温下反应8h后，反应液进行液相色谱分离，收集19.651min处峰，真空冷冻干燥，即得所述荧光单标记的眼镜蛇神经毒素。

本发明的有益效果主要体现在：本发明的制备方法专简便、快速，制备所得的FITC-NT纯度较高(90％以上)，为提高神经毒素制剂的安全性、研究神经毒素的体内过程及其制剂提供了技术支持，为大分子生物多肽的荧光单标记产物的制备和分离纯化研究提供参考。

(四)附图说明

图1为pH对衍生反应的影响，图中纵坐标为荧光强度；

图2为温度、时间对衍生反应的影响，图中纵坐标为荧光强度；

图3为FITC与NT比例对衍生反应的影响，图中纵坐标为荧光强度；

图4为FITC-NT的半制备液相(A)和分析液相(B)色谱图；

图5为制备的单标FITC-NT产物质谱图。

(五)具体实施方式