[发明专利]一种改造蛋白折叠分泌途径增强葡萄糖氧化酶分泌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种改造蛋白折叠分泌途径增强葡萄糖氧化酶分泌的方法，属于基因工程技术领域。 

背景技术

葡萄糖氧化酶是生物领域中最主要的工具酶之一。自1967年Updike和Hicks将GOD固定在Clark氧电极表面，将其应用于血糖测定以来，GOD被广泛应用于食品、饲料、医药等许多相关领域。 

在食品工业中，由于氧的存在，引起许多不利于产品质量的化学反应，并为许多微生物生长创造了条件。目前，许多国家已将GOD作为工人的安全抗氧剂而广泛应用于各种食品和食品加工工艺中。虽然用途多样，GOD的作用主要在于除葡萄糖、除氧、形成过氧化氢、形成葡萄糖酸四个方面。利用其专一氧化酶的原理，制成葡萄糖氧化酶分析仪，能快速准确简易地测定各种食品中的葡萄糖含量，指导生产。 

在医药工业中，GOD作为试剂盒、酶电极等用于血清(浆)、尿液及脑脊液中葡萄糖的体外定量分析；GOD制成的酶制剂还可用于除去或缓解牙斑、牙垢和龋齿的形成防止口腔疾病和牙病的发生。此外，由于可以催化生成H202，还可用于对H2O2敏感的淋巴瘤的导向目标的治疗。 

GOD还是一种新型的酶饲料添加剂，能够改善动物肠道环境，调节饲粮消化，促进动物生长。含葡萄糖氧化酶、乳酸过氧化物和乳铁蛋白的混合饲料添加剂，可用于预防牲畜胃肠道感染、腹泻，并有促进动物生长作用。 

从动植物组织中提取GOD有一定的局限，酶量亦不丰富；细菌GOD产酶量少；一般采用黑曲霉(具有GRAS资格)和青霉属菌株作为GOD生产菌。我国及美国均采用点青霉及产黄青霉生产GOD，日本常用尼崎青霉，俄罗斯用生机青霉，近年报道胶霉属(Clioctadium)、拟青霉属(Paecilomyces)和帚霉属(Scopulariopsis)也能生产GOD。 

产量低、酶活低、检测方法复杂是GOD产业化的限制性因素，国内外为此做了大量工作并取得了明显进展。目前国外生产的GOD厂家主要是德国的Boehringer和日本的TOYOBO。规模化生产高活性的GOD还有困难。发酵生产GOD的同时产生大量杂蛋白，分离提取复杂，成本高。 

利用基因工程或发酵工程来研究GOD的过量表达。其酶学性质、分子改造最终实现葡 萄糖氧化酶的工业化生产奠定了一定的理论基础和策略导向。 

发明内容

本发明提供了一种改造蛋白折叠分泌通路增强葡萄糖氧化酶分泌的方法，是在Pichia pastoris GS115中表达葡萄糖氧化酶基因GOD的基础上，进一步将毕赤酵母中KAR2、CNE1、ERO1、SSA4、SSO2、SEC53、BMH2、HRD1、UBC1、GCN4等基因分别克隆连接到毕赤酵母表达载体pGAPZ等系列衍生质粒进行共表达，或者对上述基因进行模块化组合表达，获得葡萄糖氧化酶分泌表达增强的菌株。 

所述改造蛋白折叠分泌通路增强葡萄糖氧化酶分泌的方法中，蛋白折叠分泌通路包括三个模块，其中，模块一包括囊泡运输基因SSA4、SSO2、SEC53、BMH2，ERAD基因HRD1、UBC1；模块二包括内质网中折叠基因KAR2、CNE1、ERO1；模块三是胁迫应激反应基因GCN4；所述改造，是表达三个模块中的任意一个基因，或同时表达模块一中的任意一个基因及模块二中任意一个基因，或同时表达模块一至三中的各一个基因。 

在本发明的一种实施方式中，SSA4基因的核苷酸序列如Gene ID:8199979所示，SSO2基因的核苷酸序列如Gene ID:8197744所示，SEC53基因的核苷酸序列如Gene ID:8199158，BMH2基因的核苷酸序列如Gene ID:8198501所示，HRD1基因的核苷酸序列如Gene ID:8201066，UBC1基因的核苷酸序列如Gene ID:8200711所示，KAR2基因的核苷酸序列如Gene ID:8198455所示，CNE1基因的核苷酸序列如Gene ID:8198102所示，GCN4基因的核苷酸序列如Gene ID:8197788所示。