[发明专利]一种反硝化细菌及其发酵生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵工程技术领域，特别涉及一种能有效利用无机氮源、抑制硫酸盐还原菌（SRB）生长繁殖的反硝化细菌及其该反硝化细菌的发酵生产方法。

背景技术

油藏注水开发导致原油生物降解及其降解的中间产物，刺激了油藏、石油管道及采油装置中的硫酸盐还原菌（SRB）的生长。硫酸盐还原菌产生大量的硫化氢，造成油藏酸化及管道的腐蚀，给全球石油工业带来了严重的损失。美国和西德科研机构最近的数据表明：SRB腐蚀仅对油田矿厂供水系统造成的损失就达7亿美元/年，对油田保持地层压力系统和矿场回收利用污水系统造成的损失就更为严重。我国大部油田如四川油气田，大庆、辽河、吉林等油田都不同程度地受到SRB腐蚀的危害，其中以四川油气田受SRB腐蚀之害最深，曾先后发生过多起因应力腐蚀引起的恶性事故。防止SRB腐蚀已是腐蚀科学和微生物学和工业系统共同关注的重要课题。

目前，投入杀菌剂是最常用的防治SRB腐蚀的方法。但SRB种类繁多，化学杀菌剂能够波及到也难于全面捕杀；同时杀菌剂的大量使用，可使细菌产生耐药性，也会给环境带来污染负荷。近年来，利用微生物来抑制或消除微生物腐蚀的研究已经受到普遍的关注，应用最为广泛的是用硝酸盐还原菌NRB（亦称反硝化细菌）作用来抑制硫酸盐还原菌的生长或产物的积累，减轻或抑制腐蚀的发生。

反硝化细菌在生活习性、生长环境等方面与硫酸盐还原菌非常相似，只是它们不产生H₂S，而生成其它对油田无害的产物或者将H₂S转化，降低SRB的腐蚀。这些细菌注入地层中，可以与SRB发生竞争，使SRB的生长繁殖受到抑制，即利用微生物之间的竞争关系来防止SRB腐蚀。该方法在不破坏环境的条件下，利用系统本身微生物的竞争生长规律治理腐蚀菌，或利用微设备危害较小，成本相对较底，因而是今后研究工作的重点。但现有技术中用于抑制硫酸盐还原菌的反硝化细菌均是中低温范围下使用的，最佳工作温度一般是20—30℃只能应用于油田地面污水处理系统，而油井和油藏等高温环境下传统的反硝化细菌并没有任何效果；并且反硝化菌种需经多次放大发酵才能发酵成适用工业应用菌液，发酵工艺繁琐，能源消耗高。因此，目前大部分反硝化细菌进行SRB的防治基本停留于室内研究或者小试阶段。

发明内容

本发明针对现有技术中反硝化细菌抑制SRB的最佳温度低，菌液的工业发酵程序繁琐、能耗高的问题，提供一种反硝化细菌，以提高反硝化细菌抑制SRB的抑制温度，并且可以简化反硝化细菌工业发酵过程。

本发明的反硝化细菌，为JSHD01地芽孢杆菌，具有序列表SEQ ID  NO：1所示的序列，保藏于中国微生物菌种保藏管理委托员会普通微生物保藏中心，拉丁文学名为 Geobacillus pallidas，保藏编号为CGMCC NO 7270 保藏日期为 2013年3月5日。

本发明还提供上述高温反硝化细菌的发酵生产方法，包括如下步骤：

1)将所述CGMCC NO 7270反硝化细菌接种在固体培养基上，50℃—60℃静止培养3-4天以形成反硝化细菌芽胞；

2）将步骤1）中培养过的固体培养基表面用无菌水洗涮，获得反硝化细菌孢子悬浮液，显微镜镜检计数芽胞含量>1×10¹⁰cfu/mL；将悬浮液经70-75℃水浴10-15min以获得发芽势强、发育一致的孢子悬浮液作为发酵生产菌种；

3）将步骤2）中孢子悬浮液生产菌种按100mL接种2000L—2400L无菌培养基的比例接种到发酵罐中进行放大培养，发酵控制条件为：接种温度63-65℃，培养温度55-60℃，罐压0.01-0.05Mpa，发酵过程中向培养基中通入经除尘杀菌后的空气，每分种通入的空气量为液体体积的0.2—0.3倍，搅拌速度为150-250rpm；发酵培养35-45h，取样镜检90%以上菌体产生芽孢后，再收集菌液获得反硝化细菌产品，所述硝化细菌产品的单位活芽胞量大于2×10⁸cfu/mL。

上述步骤1）中固体培养基的配方及各组分的质量百分比为：硝酸钠0.15-0.2%，乙酸钠0.075-0.1%，磷酸二氢钾0.05-0.1%，葡萄糖0.075-0.1%，硫酸镁0.01-0.02%，天冬氨酸0.04-0.05%，三氯化铁0.005-0.01%，酵母膏0.01-0.012%，琼脂1.5-2.0%，余量为水，pH值7.0-7.2。