[发明专利]特异结合胸膜肺炎放线杆菌血清7型抗原的单克隆抗体及试剂盒

权利要求书

1.一种分泌特异结合胸膜肺炎放线杆菌血清7型抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其保藏编号为CGMCC No.9051。

2.一种特异结合胸膜肺炎放线杆菌血清7型抗原的单克隆抗体，由权利要求1所述的杂交瘤细胞系分泌产生。

3.一种如权利要求2所述单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

步骤1、制备免疫原：配制巧克力培养基，将胸膜肺炎放线杆菌血清7型标准菌株复苏，大量培养，用生理盐水洗菌，离心，弃上清，细菌沉淀用生理盐水洗悬浮，离心，生理盐水悬浮的S7细菌全抗原作为免疫原；

步骤2、小鼠免疫：通过反复多次小剂量的小鼠皮下免疫，挑选可分泌高效价的抗App血清7型多克隆抗体的小鼠；

步骤3、细胞融合：取免疫小鼠脾脏细胞，通过体外与小鼠骨髓瘤细胞融合；

步骤4、阳性杂交瘤细胞筛选：用间接ELISA试验筛选抗胸膜肺炎放线杆菌血清7型抗原的阳性杂交瘤细胞；

步骤5、阳性杂交瘤细胞的获得：选择强阳性反应的杂交瘤细胞，用有限稀释法连续克隆3次，最后一次克隆后检测为阳性的孔所得细胞株即为稳定分泌的、特异的抗胸膜肺炎放线杆菌血清7型抗体的杂交瘤细胞株；

步骤6、杂交瘤细胞的培养与保存：将阳性杂交瘤细胞扩增培养，收集细胞；一部分用于生产小鼠腹水抗体，另一部分液氮保存。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1具体为：配制巧克力培养基，将胸膜肺炎放线杆菌血清7型标准菌株复苏，大量培养，用生理盐水将菌洗下，8000r/min离心10min，弃上清，细菌沉淀用生理盐水洗悬浮，离心，如此洗菌3次。细菌沉淀用含0.5％甲醛生理盐水悬浮，放置4℃过夜灭活，8000r/min离心10min去除甲醛，用生理盐水洗3次。生理盐水悬浮的S7细菌全抗原作为免疫原。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2具体为：将上述免疫原与等体积的福氏完全佐剂混合乳化，对8周龄的BALB/C雌鼠做腹腔注射，3-4周后用同样免疫原乳化在福氏不完全佐剂中，作第二次腹腔注射，2-3周后用免疫原作最后一次腹腔注射，三天后取小鼠脾脏用于细胞融合。

6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤3具体为：取免疫小鼠脾脏细胞，通过体外与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按5-10:1的比例在50％PEG下融合，用HAT培养基筛选；融合细胞培养5d后，用HAT培养基再换液一次，第10d用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔低5％-30％时，取上清用间接ELISA方法筛选。

7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤4中，筛选时包被抗原为App S7型经反复冻融3次处理的抗原，所述抗原以1:5000稀释，并以其它血清型的App为阴性对照。

8.一种体外化学标记处理的如权利要求2所述的特异结合胸膜肺炎放线杆菌血清7型抗原的单克隆抗体。

9.一种如权利要求8所述的单克隆抗体，其特征在于，所述体外化学标记处理的步骤如下：

1)将腹水单克隆抗体用硫酸铵纯化；

2)用改良过碘酸钠法将抗体与HRP偶联，盐析法去除样品中未结合的HRP，最终产物对PBS透析过夜，即得到体外化学标记过的辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体。

10.一种竞争ELISA检测胸膜肺炎放线杆菌血清7型抗体试剂盒，其特征在于，主要包括：胸膜肺炎放线杆菌血清7型抗原；如权利要求3所述的体外化学标记处理的可特异结合胸膜肺炎放线杆菌血清7型抗原的单克隆抗体；胸膜肺炎放线杆菌血清7型阳性对照血清；阴性对照血清。