[发明专利]特异结合胸膜肺炎放线杆菌血清7型抗原的单克隆抗体及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和动物检疫技术领域，具体涉及一种特异结合胸膜肺炎放线杆菌血清7型抗原的单克隆抗体及分泌它的杂交瘤细胞系，此外,本发明还涉及一种竞争ELISA检测胸膜肺炎放线杆菌血清7型抗体试剂盒。

背景技术

猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumoniae)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，简称App)引起的猪的一种呼吸道传染病，具有高度传染性，多呈最急性或急性病程而迅速致死，其发病率和死亡率都在50％以上，最急性型的死亡率可高达80-100％，慢性型可导致猪生长缓慢，成为僵猪，该病是集约化猪场常见猪病之一，是我国进口种猪检疫的猪病之一。我国曾多次从美国、丹麦、英国等进口种猪中检出猪传染性胸膜肺炎。根据胸膜肺炎放线杆菌可溶性抗原荚膜多糖和脂多糖抗原性的差异，可将其分为15个血清型。血清学抗体检测是最重要的诊断方法之一。

由于App各型之间没有完全的交叉保护，App每个血清型的毒力不同，每个血清型在各个国家的分布也不同，因此，准确诊断感染血清型是预防和控制该病的基础。App血清7型是重要的致病血清型，我国从美国、加拿大进口种猪都要求检疫此血清型。根据吉林大学雷连成等从我国长春分离的App菌株毒力测定，血清7型对小鼠的致死率很高，达66.5％。

ELISA检测方法方便、快速、敏感、特异，是抗体检测最常用的方法。

此检测方法不需要昂贵的仪器，几乎所有的检测单位都备有ELISA仪，ELISA试剂盒很容易推广应用。就App而言，目前国内外商品化ELISA检测试剂盒还没有只检测血清7型抗体的试剂盒。也没有采用竞争ELISA检测App抗体的试剂盒。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供能与App血清7型抗原特异结合的单克隆抗体。

本发明要解决的技术问题之二是提供分泌产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞系。

本发明要解决的技术问题之三是提供本发明的单克隆抗体的制备方法。

本发明要解决的技术问题之四是提供一种体外化学标记过的单克隆抗体。

本发明要解决的技术问题之五是提供基于上述单克隆抗体研制的竞争ELISA检测胸膜肺炎放线杆菌血清7型抗体试剂盒。

本发明是通过以下技术方案实现的：

在本发明的一方面，提供一种分泌特异结合胸膜肺炎放线杆菌血清7型抗原的单克隆抗体的杂交瘤单克隆细胞，代号为SHCIQ-S7-8D12杂交瘤细胞株，经间接ELISA和竞争ELISA检测，证实其所分泌的单克隆抗体能够特异识别并结合胸膜肺炎放线杆菌血清7型抗原。该杂交瘤细胞株已于2014年4月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.9051，保藏地点：中国，北京。

在本发明的另一方面，提供一种特异结合胸膜肺炎放线杆菌血清7型抗原的单克隆抗体，由上述保藏编号为CGMCC No.9051的杂交瘤细胞系分泌产生。

本文所采用的术语“单克隆抗体(单抗)”指从一纯系细胞得到的免疫球蛋白，具有相同的结构和化学特性，对单一抗原决定簇有特异性。单克隆抗体与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤或重组工程细胞培养获得，不会混杂有其它免疫球蛋白。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。

本文所采用的术语“杂交瘤细胞系”(英文名称：hybridoma cell line)，指从杂交瘤细胞中筛选培养出的细胞系。

在本发明的另一方面，提供一种上述单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

步骤1、制备免疫原：配制巧克力培养基，将胸膜肺炎放线杆菌血清7型标准菌株复苏，大量培养，用生理盐水洗菌，离心，弃上清，细菌沉淀用生理盐水洗悬浮，离心，生理盐水悬浮的S7细菌全抗原作为免疫原；

步骤2、小鼠免疫：通过反复多次小剂量的小鼠皮下免疫，挑选可分泌高效价的抗App血清7型多克隆抗体的小鼠；

步骤3、细胞融合：取免疫小鼠脾脏细胞，通过体外与小鼠骨髓瘤细胞融合；

步骤4、阳性杂交瘤细胞筛选：用间接ELISA试验筛选抗胸膜肺炎放线杆菌血清7型抗原的阳性杂交瘤细胞；