[发明专利]电穿孔转染干扰RNA到细粒棘球绦虫的方法

权利要求书

1.电穿孔转染干扰RNA到细粒棘球绦虫的方法，包括下述步骤：1)细粒棘球蚴原头节在含有青霉素和链霉素的RPMI 1640培养基中培养1-5天；2)清洗培养后的细粒棘球蚴原头节，将其加入到RPMI 1640培养基中，接着加入电转缓冲液、干扰RNA到电极杯中，利用电转仪对细粒棘球蚴原头节进行转染；3)转染好的细粒棘球蚴原头节静置后转移至含有RPMI 1640培养基的无菌培养皿中，在孵育箱内培养。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于还包括下述步骤：4)通过RT-PCR检测转染后细粒棘球蚴原头节内GRP78mRNA表达水平,Western blot检测转染后细粒棘球蚴原头节内GRP78蛋白表达水平，鉴定转染效果。

3.根据权利要求1的方法，其特征在于在步骤1)中，青霉素和链霉素的含量为100U/mL，培养条件为37℃、5％CO₂恒温培养。

4.根据权利要求1的方法，其特征在于在步骤2)中，干扰RNA的浓度为3μmol/L-8μmol/L，转染时间为0.5-72h。

5.根据权利要求1的方法，其特征在于在步骤2)中，清洗方法为细粒棘球蚴原头节用磷酸盐缓冲液清洗，再用无菌的DEPC处理水清洗。

6.根据权利要求1的方法，其特征在于在步骤2)中，电转缓冲液是如下两种电转缓冲液的混合物：电转缓冲液I为加入三磷酸腺苷二钠盐2g，六水氯化镁1.2g，然后注入双蒸水使溶液达到10ml，过滤除菌；电转缓冲液II为加入磷酸二氢钾6g，碳酸氢钠0.2g，葡萄糖0.2g，然后调节pH到7.4，接着注入双蒸水使溶液达到500ml，过滤除菌。

7.根据权利要求6的方法，其特征在于电转缓冲液I与电转缓冲液II的用量比为80ul：4ml。

8.根据权利要求1的方法，其特征在于在步骤2)中，采用Amaxa 2型电转仪，转染参数为D023或U033程序。

9.根据权利要求1的方法，其特征在于在步骤3)中，培养条件为37℃，5％CO₂恒温培养。

10.根据权利要求1的方法，其特征在于所转染的干扰RNA靶向细粒棘球绦虫的GRP78基因，其靶序列为GGTTTCGGCTATGGTTCTT，或GGACATTACAAAGGATGT，或CCTCGTGGTTTACCTCAAA。