[发明专利]电穿孔转染干扰RNA到细粒棘球绦虫的方法

说明书

技术领域

本发明公开了使用电穿孔将干扰RNA转染到细粒棘球绦虫的方法，属于生物实验技术领域。

背景技术

棘球蚴病(echinococcosis)俗称包虫病(hydatid disease)，是棘球蚴绦虫的中绦期幼虫寄生于人及其他一些动物体内所引起的一种严重危害人体健康和畜牧业发展的人畜共患寄生虫病。棘球绦虫的种类较多，目前在我国主要有细粒棘球蚴病(囊型包虫病cystic echinococcosis，CE)和多房棘球蚴病(泡型包虫病alveolar echinococcosis，AE)两种，其分别由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus，E.g)和多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis，E.m)寄生于人及某些动物体内所致。细粒棘球蚴病呈全球性分布，在我国主要流行于新疆、青海、内蒙古、西藏等畜牧业发达的省区。

细粒棘球蚴可寄生于人体任何部位，其中肝脏最为常见(50-70％)，其次为肺脏(占20％～30％)，在脾，肾，骨，脑及其他器官中较少见到。目前，对于肝细粒棘球蚴病的治疗，仍然以外科手术为主，药物治疗为辅。对于手术治疗方式而言，一个严重的缺陷是内囊摘除过程中易引起内囊里的原头节外溢，复发率较高。即使近些年出现的肝包虫外膜内外囊完整摘除术可完整摘除肝包虫外囊，降低包虫病的复发率，但是当包虫囊肿体积较大或紧贴重要脏器或管道(肝门或胆管)时，则需要选择开放式外膜内完整摘除术。此种术式有两种情况：一是开放式外膜内外囊完全切除术，二是开放式外膜内外囊次全切除术，这两种情况都可能有头节的外漏和残留，增加术后复发的风险。因此本领域近年来已经开始尝试使用药物制剂来降低复发率。

迄今为止，国内外已经在体外、动物及临床上对95％乙醇，高渗盐水，5％的福尔马林，硝酸银及阿苯达唑等药物及其联合作用效果方面进行了广泛的研究，它们虽然可以起到一定的疗效，但都不尽理想且副作用较大：95％的乙醇可导致机体出现严重的肝胆并发症，20％的高渗盐水会使病人出现严重的肝胆并发症，10％H2O2会致使机体出现空气栓赛甚至会发生过敏性休克，福尔马林使用后会产生严重的肝胆并发症，20％的硝酸银可致使病人出现术中休克，心血管功能衰竭，肾功能衰竭，肝功能不全等副作用，术后发生呼吸困难，紫绀，低血压等一系列副作用，阿苯达唑(ABZ)临床上病人使用后，肝酶水平会因此而上升，高浓度酸性和碱性溶液尽管能有效杀灭，但是无法在人体内应用，而低浓度的酸性和碱性溶液杀灭效果不理想。

最近几年来，本领域技术人员尝试将分子生物学的治疗方案应用于包虫病的治疗，这种方案集中体现在利用RNA干扰技术抑制与细粒棘球蚴生长密切相关的基因到蛋白的表达，从而使得靶基因沉默，杀灭细粒棘球蚴。针对细粒棘球蚴而言，如何将小分子的干扰RNA进入到目标体内是本领域面临的一项技术难题，常见方法例如浸泡法效果并不理想，转染方法，例如病毒介导法，腺病毒，阳离子脂质体法等，研发发现通过脂质体法和腺病病毒法转染细粒棘球蚴原头节，未达到干扰RNA沉默原头节靶基因的目的，因此本领域目前迫切需要一种操作简单、条件明确、能有效实现干扰RNA功能的转染方法。

发明内容

申请人多年来致力于棘球蚴病的治疗研究，尤其是致力于研究细粒棘球蚴病在细胞和基因层面的致病机理，发现在细粒棘球蚴病中细粒棘球蚴原头节存在GRP78蛋白(分子伴侣葡萄糖调节蛋白78，glucose-regulated protein78/binding immunoglobulin protein，GRP78)的高表达，从而确定内质网应激反应参与细粒棘球蚴发病。在该研究过程中，申请人通过创造性的努力发明了一种利用电穿孔成功实现转染干扰RNA到细粒棘球绦虫的方法，利用该方法转染干扰RNA能够成功的实现靶基因的沉默，从而抑制和杀灭细粒棘球蚴原头节的生长，从而有效治疗细粒棘球蚴病。

基于上述，本发明公开了一种电穿孔转染干扰RNA到细粒棘球绦虫的方法，包括下述步骤：1)细粒棘球蚴原头节在含有青霉素和链霉素的RPMI 1640培养基中培养1-5天；2)清洗培养后的细粒棘球蚴原头节，将其加入到RPMI 1640培养基中，接着加入电转缓冲液、干扰RNA到电极杯中，利用电转仪对细粒棘球蚴原头节进行转染；3)转染好的细粒棘球蚴原头节静置后转移至含有RPMI 1640培养基的无菌培养皿中，在孵育箱内培养。