[发明专利]用于鉴定地顶孢霉诱变株MKL18的引物对和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于菌种鉴定技术领域，具体涉及一种用于鉴定地顶孢霉诱变株MKL18的引物对和试剂盒。

背景技术

冬虫夏草是一类珍惜宝贵的传统中药材，在传统中医和现在医学临床中均有较广泛的应用。野生虫草对其生长条件要求苛刻，导致产量较低，所以利用其真菌无性形进行工业化深层发酵，生产各种药物、营养保健品和饲料添加剂等，已经广为多见。通过挖掘丰富的野生资源、以及实验室人工诱变，各种具有优质生产性能的菌株也广为报道。

由于虫草真菌无性形的分离鉴别方法尚不十分系统规范，对一些野生分离株的鉴定，大多还是采用外观及显微形态的描述作为分类依据。这不仅给虫草真菌的分类带来一定程度的混乱，也使得一些具备优异生产性能的菌种及其相关的知识产权，难以得到实质意义的保护。

如何建立一种方法，方便且特异性地表征并进而保护这些生产性能好的优质菌株、特别是其中的一些专利菌株，是一个现实的问题。

核糖体RNA基因序列(rRNA基因，或称rDNA)在进化过程中是十分保守的，因此随着分子生物学技术的发展，rDNA序列已经被广泛应用于系统生物学中。18S rDNA序列用于真菌的系统分类和进化树的建立，也已经比较普遍。

申请号为201410016617.2的中国专利文献公开了一种地顶孢霉诱变株MKL18(Acremonium terricola MKL18)，其保藏编号CCTCC No.M2013654。该地顶孢霉诱变株属于虫草真菌，用于生产一种绿色饲料添加剂。与出发野生菌株相比，地顶孢霉诱变株MKL18生长优势明显，在察氏培养基中摇瓶发酵时，同期生物量可提高32％；菌丝体中腺苷、麦角甾醇、粗蛋白和多糖的含量分别提高12％(腺苷)、42％(麦角甾醇)、8％(粗蛋白)和35％(多糖)，而这些活性成分赋予了地顶孢霉菌发酵产物促生长、抗肿瘤、提高免疫等功效；并且这些优异的生产性能都能随菌株繁殖而稳定遗传。

然而，地顶孢霉诱变株MKL18和野生出发菌株相比，两者在菌落和显微形态上没有任何差异，无法通过肉眼或显微观察进行区分。申请人虽然就该菌株提出了发明专利申请并在保藏机构保藏了菌种，但是对于这一优质生产菌种，如因生产企业内部的原因导致可能的流失外泄，将不能很好监控鉴别。

发明内容

本发明提供了一种用于鉴定地顶孢霉诱变株MKL18的引物对，利用该引物对对菌株18S rDNA部分序列进行分析，能将地顶孢霉诱变株MKL18与其野生出发菌株区别开来。

用于鉴定地顶孢霉诱变株MKL18(Acremonium terricola MKL18)的引物对，碱基序列为：

正向引物：5'-CCAATGCCCTTCGGGGCTCTCTGG-3'；

反向引物：5'-GGGATTGGGTAATTTGCGCGCCT-3'。

申请人发现，在对野生型地顶孢霉进行诱变时，获得的地顶孢霉诱变株MKL18除了获得更加优异的菌种性能外，还使得18S rDNA序列发生了变异。虽然18S rDNA序列的变异与新菌种性能之间并无直接关联(即新菌种性能的产生并非是18S rDNA序列变异引起的)，但该变异后的18S rDNA序列、新菌种性能均能随菌株繁殖而稳定遗传；这就使得通过对18S rDNA序列进行分析，能够将菌落和显微形态极为相似的地顶孢霉诱变株MKL18与其野生出发菌株区分开来。

在此基础上，在Genebank上输入“Acremonium 18S rRNA”，检索到顶孢霉属各种相关序列370余条(详见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore？term＝acremonium+18S+rRNA)；而输入“Acremonium terricola 18S rRNA”后搜索，则仅有一条序列，且该序列只包含18S rDNA中的33个碱基(详见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/20385397)。参考Glenn AE.et al发表的文献(Molecular phylogeny of Acremonium and its taxonomic implications.Mycologia,1996,88:369)，我们选择顶孢霉属18S rDNA中一段长度为230bp、比较保守的序列，设计了本发明的引物对，用于鉴定地顶孢霉诱变株MKL18。

本发明还提供了一种用于鉴定地顶孢霉诱变株MKL18的试剂盒，包含有引物对，所述引物对即为本发明所述用于鉴定地顶孢霉诱变株MKL18的引物对。