[发明专利]一种高纯度眼镜蛇神经毒素的提取方法及含有该毒素的药物组合物

说明书

技术领域

本发明申请涉及一种高纯度眼镜蛇毒神经毒素的提取方法及以该毒素为单一有效成分的药物组合物，所述药物组合物适合口服、口腔吸收和直肠给药，特别涉及一种以高纯度科博肽为主药的口服、口腔吸收、直肠给药的制剂，属于生物和生化制药领域。

背景技术

神经毒素(neurotoxin，NT)是蛇毒中一类重要的活性组分，主要分布在眼镜蛇科和海蛇科及蝰科的响尾蛇蛇毒中。纯化的微量眼镜蛇毒神经毒素具有类似吗啡的中枢镇痛作用，用于顽固性疼痛、恶性肿瘤疼痛和关节痛的镇痛治疗。NT的镇痛作用有别于阿片类药物，表现为效价高、持续时间长、无耐受性和成瘾性，是一种很有潜力的新型镇痛药。研究表明，NT的含量以眼镜蛇毒中含量较高，从眼镜蛇毒中分离出的NT具有长短链两种，其中以短链NT镇痛效果更好。

科博肽系从湖南眼镜蛇(Naja Naja Atra)蛇毒中分离纯化的短链NT，是由68个氨基酸组成的单链多肽，四个二硫键维系其空间结构，分子量为7000道尔顿左右，适用于晚期癌症疼痛、慢性关节痛、坐骨神经痛、神经性头痛、三叉神经痛、麻风反应神经痛等慢性疼痛的治疗，尤其用于慢性、顽固性、持续性疼痛的治疗，现临床使用为肌注给药和口服复方制剂(科博肽、曲马多和布洛芬的组合物)给药。

蛇毒中成分复杂，其中蛋白质占干重的90％，包括5-15种酶、3-12种非酶性蛋白质或多肽，另含5-20％小分子肽、氨基酸、糖类、脂类等等。眼镜蛇毒中已经研究确定的成分有膜活性多肽、神经毒素、神经生长因子、溶血素(DLP)、CVA蛋白、眼镜蛇毒因子等及其他成分，如碱性磷酸单酯酶、磷酸二酯酶、乙酰胆碱酯酶、L-氨基酸氧化酶、核糖核酸酶、蛋白水解酶等。目前，眼镜蛇神经毒素和科博肽的提取，主要使用盐析(硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁等中性盐)、阳离子柱层析、亲和层析等方法组合提取。其存在的缺陷主要有：盐析沉淀经过蛋白变性、复性的过程，杂蛋白共沉淀比较多，活性蛋白损失大，在蛇毒处理过程中，价格昂贵的蛇毒资源损失严重；亲和层析填料制备困难，使用条件苛刻，大规模长期使用亲和填料容易被蛇毒杂蛋白质毒化、重现性差；阳离子柱层析只对某些类型的碱性蛋白酶、多肽、核酸类杂蛋白能够按目标蛋白分子所载电荷实施有效分离，但是对于蛇毒中复杂的其他成分或电荷相差不大的蛋白酶、多肽的分离提取存在很大的局限性，部分研究得到的神经毒素和科博肽纯度只达到SDS-PAGE电泳纯。因此，从眼镜蛇毒中有效、稳定、重现性好的提取高纯度的神经毒素和科博肽是一项复杂困难的工作。

现有国家药品质量标准中对单组份生物、生化药品的纯度要求通常为：SDS-PAGE电泳一条带或HPLC含量大于90％，如科博肽国家药品标准(WS1-XG-009-2000)、或降纤酶国家药品标准(WS1-XG-031-2000)；HPLC含量大于95％或更高的的生物、生化单组份的高纯度的药物意味着制剂中与治疗作用无关的杂物质含量更少，这对于保证药品的质量、疗效、改善药物作用的时效、减少药物的毒副反应都具有重要意义。

科博肽国家药品标准(WS1-XG-009-2000)规定要求：按干燥品计算，神经毒蛋白含量不得少于35.0％；HPLC纯度检查主峰相对百分含量不得少于90.0％。而药品原料的含量和纯度，在保证药品质量、疗效、安全性、用药剂型等方面具有决定作用。现有市售科博肽产品，存在原料批次间含量和纯度相对低、临床疗效不稳定、起效时间慢(陈汝筑，吴秀荣.眼镜蛇神经毒素的镇痛作用[J].中国药理学通报，1988，4(2)：113.实验动物注射眼镜蛇神经毒素后2小时，大鼠痛阈显著上升，3小时后达到较佳效果，NT镇痛作用起效慢，但维持时间长。陈燕，许云禄.舟山眼镜蛇神经毒素的分离纯化及镇痛作用研究[J].海峡药学，2007，19(12)：27.小鼠动物实验显示，给药后2小时起效，4小时作用达峰值。朱天新，袁彩君，任晚琼.眼镜蛇神经毒素的规模化制备及其镇痛作用的研究[J].华西药学杂志，2007，22(3)：247～249.小鼠热板试验、大鼠电嘶叫试验和小鼠扭体试验结果基本一致，显示CNT具有较强的镇痛作用，且具有起效缓慢的特点)、科博肽单方制剂只可肌肉注射给药、病人用药顺应性差等缺陷。