[发明专利]一种治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的制备方法和用途及其药效验证方法

权利要求书

1.一种治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的制备方法，其特征在于，首先构建慢病毒表达载体-HIF-1α-shRNAi，然后将HIF-1α-shRNAi重组质粒包装成药剂，即为治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物。

2.根据权利要求1所述的治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的制备方法，其特征在于，HIF-1α-shRNAi的慢病毒表达载体的构建：采用DNA重组技术将HIF-1α-RNAi双链定向亚克隆入PU6启动子即可。

3.根据权利要求1或2所述的治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的制备方法，其特征在于，所述HIF-1α-shRNAi的慢病毒表达载体的构建：采用pGCSIL-GFP载体，转染细胞为293T细胞。

4.一种如权利要求1或2所述的制备方法制备的治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的应用，其特征在于，将治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物注射到粒肉鸡体内，沉默HIF-1α基因，抑制下游基因血管内皮生长因子(VEGF)、体内内皮素-1(ET-1)、胰岛素样生长因子II(IGF-II)的表达。

5.一种如权利要求4所述的应用的药效验证方法，其特征在于，包括：(1)RNA干扰HIF-Iα基因对肉鸡PAEC生长实验和(2)RNA干扰HIF-1α基因在肉鸡体内对腹水形成实验；

步骤(1)RNA干扰HIF-1α基因对肉鸡PAEC生长实验，具体包括：(1.1)鉴定RNA干扰靶点是否成功连接到慢病毒载体；(1.2)HIF-1α-shRNAi细胞转染；(1.3)模拟缺氧实验；(1.4)细胞的爬片与DAPI染色；(1.5)HIF-1a、VEGF、ET-1基因表达量的检测；

步骤(2)RNA干扰HIF-1α基因在肉鸡体内对腹水形成实验，具体包括：(2.1)人工诱导肉鸡腹水征合症试验；(2.2)动物分组；(2.3)动物接种；(2.4)检测。

6.根据权利要求5所述的药效验证方法，其特征在于，步骤(1.2)HIF-1α-shRNAi细胞转染是借助Lipofectamine 2000转染细胞，筛选出最佳的干扰靶点。

7.根据权利要求5所述的药效验证方法，其特征在于，步骤(2.1)人工诱导肉鸡腹水征合症试验是采用三利用环境低温、饲料添碘甲状腺原氨酸(T3)诱发肉鸡腹水征合症。

8.根据权利要求5-7之一所述的药效验证方法，其特征在于，步骤(1)RNA干扰HIF-1α基因对肉鸡PAEC生长实验：通过RNA干扰技术、细胞转染进行分组实验，利用RT-PCR、荧光定量PCR、Western Blot流式细胞仪检测方法对HIF-1α、VEGF、ET-1基因表达进行检测以验证RNA干扰HIF-1α基因在肉鸡PAEC中的效果。

9.根据权利要求5-7之一所述的药效验证方法，其特征在于，步骤(2)RNA干扰HIF-1α基因在肉鸡体内对腹水形成实验：择用正常肉鸡和人工诱导的腹水征合症肉鸡为实验对象，采用RNA干扰技术进行肉鸡体内实验，以测定肉鸡中右心室重与全心室重的比值(RV/TV)、红细胞总数(PCV)、红细胞压积(HCT)、血红蛋白含量(Hb)、血清中丙二醛(MDA)、胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、乳酸脱氢酶(LDH)指标，从而分析RNA干扰HIF-1α对肉鸡腹水发病过程中生理生化指标的变化；与此同时，再通过RT-PCR、实时荧光定量PCR、Western Blot、免疫组化方法检测各组织中的HIF-1α、VEGF、ET-1基因mRNA的表达情况；最终结合以上实验结果，验证肉鸡体内RAN干扰HIF-1α对肉鸡腹水形成的影响。