[发明专利]一种治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的制备方法和用途及其药效验证方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因治疗技术领域，具体是一种治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的研制方法。

背景技术

肉鸡腹水综合征(ascites syndrome，AS)又称肉鸡肺动脉高压综合征(pulmonary hypertension syndrome，PHS)，是在各种因素作用下造成肉鸡相对缺氧或肉鸡生长过快，肺的容积与体重的增加不成正比，在此情况下，由于氧无法满足机体的正常需要，致使其呈现血液黏稠、血容量增加、肝肿大、肺瘀血水肿及肺动脉高压等病理现象，这种在临床上以腹腔积液和右心室肥大、扩张等为主要特征，被视为一种营养代谢病，也是公认的严重危害肉鸡养殖业的疾病之一。该病以肉鸡多发，冬季和早春易发，且分布范围广。北美、玻利维亚、秘鲁、墨西哥、南非、英国、美国、澳大利亚、德国、加拿大、意大利、日本等国家。近年来全球对AS调查发现，其发病率达10％～40％，呈上升趋势，平均发病率为4.2％，年死亡率超过25％，每年约有70亿只肉鸡受到腹水综合征的侵害，经济损失高达100亿美元。显然该病业已成为严重危害肉鸡养殖业发展的全球性问题。

自从肉鸡AS报道以来，不断有国内外学者对其病因进行了大量的研究，他们认为大多数肉鸡AS的诱发原因主要源于生长过快、组织缺氧、饲养密度过高、海拔过高、温度过低、高钠日粮及低硒日粮、低磷、低VC、VE等因素。其原因是这些诱因均可引起机体相对性缺氧，而对氧的消耗量已超过其心肺功能供氧的极限临界点，以致于机体处于缺氧状态，最终导致肺动脉高压而形成腹水。

近年来，有关HIF-1α与肉鸡AS的研究也有些许报道，曾秋凤等采用RT-PCR技术检测正常肉鸡和AS患鸡肺脏HIF-1αmRNA，结果表明，AS患鸡肺脏HIF-1αmRNA表达丰度极显著高于正常肉鸡(P＜0.01)，揭示了HIF-1α与腹水综合征高度相关性。Zhang等证明了肉鸡食用高盐的饮水可以增加HIF-1αmRNA表达，引起肉鸡腹水发生。Toshiyuki等对鸡胚心室肌细胞中HIF-1α基因进行了cDNA克隆，得到了HIF-1α基因全长cDNA序列等。但是利用阻断HIF-1α基因在肉鸡AS治疗上还未见相关研究，因此，抑制HIF-1α的活性为治疗肉鸡AS提供了新靶点。目前，RNA干扰HIF-1α基因的国内外研究主要在哺乳动物和人的研究较多，在肿瘤疾病中治疗，如Wang等通过HIF-1α-shRNAi转染到人乳腺癌细胞中，发现HIF-1α与VEGF基因表达量分别下降了91.63％、66.8％，从而抑制乳腺癌细胞的生长。Zhou等应用RNA干扰HIF-1α将有效地抑制口腔鳞状细胞癌的发展，特别是抑制和预防癌症细胞的血管生成和生存，因此，它可以作为一种强有力的和特定的治疗口腔癌。Chen等利用RNA干扰HIF-1α在小鼠肿瘤研究中，发现HIF-1α和血管内皮生长因子的表达明显减少，抑制肿瘤血管生成和减毒转移，显著抑制肿瘤的生长。Min等在人肺腺癌多药耐药细胞的RNA干扰HIF-1α实验中发现多药耐药基因及蛋白显著减少。此外，RNA干扰还在肝、呼吸系统及眼科等疾病中也得到广泛应用。以上RNA干扰HIF-1α基因的研究成果为本发明探索RNA干扰HIF-1α基因对肉鸡腹水的形成机理提供了非常重要的思路。

综上所述，肺动脉高压是对适应缺氧反应时机体的一种表现，同时在许多疾病中也是一种重要的病理生理症状。目前的研究发现，HIF-1α是调控肺动脉高压的中心环节。

发明内容

本发明的目的在于提供一种治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的研制方法，本发明利用RNA干扰技术来阻断HIF-1α基因在肉鸡PAEC/肉鸡AS中有效作用。主要通过检测HIF-1α、ET-1、VEGF基因表达及生理生化指标情况，进一步研究参与低氧环境中PAEC增殖与凋亡的作用机制等，并更深入地从分子水平上阐明RNA干扰HIF-1α在肉鸡AS发生作用机制，将可能为临床肉鸡AS的预防和治疗提供一种新的途径和方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的制备方法，首先构建慢病毒表达载体-HIF-1α-shRNAi，然后将HIF-1α-shRNAi重组质粒包装成药剂，即为治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物。

作为本发明进一步的方案：HIF-1α-shRNAi的慢病毒表达载体的构建：采用DNA重组技术将HIF-1α-RNAi双链定向亚克隆入PU6启动子即可。