[发明专利]环介导等温扩增检测Miltenberger血型

说明书

技术领域

本发明涉及医学检测领域，特别是涉及一种利用环介导等温扩增技术检测Miltenberger血型Mur抗原的基因检测方法，适用于GP.Mur、GP.Bun、GP.HF和GP.Hop的检测。

背景技术

1927年Landsteiner和Levine发现了人类MNS血型，该血型系统抗原的多态性数目仅次于Rh血型系统。Miltenberger血型系统是MNS系统中一类相对稀有的子系统，是因血型糖蛋白A（GPA）和血型糖蛋白B（GPB）编码基因发生重组交换而形成的一组变异抗原，由Mia、Vw、Mur、Hil、Hut、MUT、Hop、Nob、DANE、TSEN和MINY共11种抗原交叉组成11种不同的表现型。Mur抗原（MNS10）在西方人群中呈现低频率分布，临床研究意义不大。但在亚洲人群中却具有较高的分布频率，约占人口总数的5%～10%，其中泰国为9.7%，香港和台湾分别为6.28%和7.3%，广州为6.59%，合肥为1.87%。Mur抗原因常引起急性溶血性输血反应和新生儿溶血病而愈加受到临床重视。

分析表明，Mur的产生是由于GYPB假外显子片段被GYPA外显子3的5’端和内含子3的3’端替换，生成了复合外显子GYP（B-A-B），使得GYPA片段替换的是GYPB假外显子上无功能的剪接位点，该位点被GYPA上功能性的剪接位点替换后，可以表达新的复合外显子。也有学者认为GYPB的假外显子3编码生成了N端第34～41位，氨基酸特异性序列34YPAHTANE41表达Mur抗原。由于GP(B-A-B)Mur、GP(B-A-B) Hop、GP(B-A-B)Bun中均含有被GYPA插入片段激活的GYPB假外显子的表达产物，故都表达Mur抗原，这给Mur的基因检测提供了分子基础及理论依据。

目前，对Mur抗原的的检测方法主要还是依赖传统的血清学方法，但是由于Miltenberger血型的谱细胞和血清都难以获得并大量普及，所以严重制约了研究和应用的开展。虽然利用PCR方法可以解决目前的困难，但是PCR的设备要求较高、操作繁琐而且耗时较长。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种Miltenberger血型Mur抗原的基因检测方法，该方法快速、灵敏、特异且操作简单实用。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种Miltenberger血型Mur抗原的基因检测方法，用于GP.Mur、GP.Bun、GP.HF和GP.Hop的检测，采用环介导等温扩增技术（LAMP）检测，包括步骤为：LAMP引物的设计；血液基因组DNA的提取；LAMP的扩增样品中的目的片段和结果的判定。

在本发明一个较佳实施例中，所述LAMP引物的设计是以genbank号为JN201202.2的序列为模板，靶位点的选择在7至191位之间，所述引物的Tm值在60-65℃之间，GC含量在50%-60%之间。

在本发明一个较佳实施例中，所述血液基因组DNA的提取方法采用硅基磁珠法、酚氯仿抽提法、盐酸胍法、硅胶柱试剂盒法或全血煮沸法。

在本发明一个较佳实施例中，所述LAMP引物的DNA序列为：

F3：AGATAAGCACAAACGGGA；B3：GTTTGAGAACTGTCATGAGTT；

FIP：GGAGGGTAAACAGTTCTAACAGATTTTCACATATCCAGCTCATACTGC；BIP：AAGAGGAAACCGGTATGTTCTTAGTTTTTAGCTCGTGTAAATAGAGTTCAA。

在本发明一个较佳实施例中，所述F3/B3与FIP/BIP的物质的量浓度比为1：4。

在本发明一个较佳实施例中，所述LAMP扩增反应的过程为：当采用25 μL体系时，F3/B3各10 pmol，BIP/FIP各 40 pmol，5 mmol/L MgSO₄，2.5 μL 缓冲液，1 μL BstDNA聚合酶，50 ng 目标DNA，水补足体积至25 μL，其中2.5 μL 缓冲液包括pH为8.8的20 mM Tris-cl、10 mM KCl、10 mM (NH₄)2SO₄，0.1% Triton X-100，将上述除BstDNA聚合酶以外的试剂混匀置于PCR管中，95℃5分钟，立即冰浴3分钟，加入1 μL BstDNA，65℃，40 min，80℃，10 min终止反应。