[发明专利]小麦中类胡萝卜素含量的超高效液相色谱测定方法

说明书

技术领域

本发明属于色谱检测领域，具体涉及小麦中类胡萝卜素含量的超高效液相色谱测定方法。

背景技术

我国是世界上最大的小麦生产国和消费国，每年种植面积约为2400万公顷，总产量约为1.1亿吨，在国民经济中占有重要的地位。随着经济的发展与人民生活水平的提高，消费者更加注重面制品营养品质和其外观品质。类胡萝卜素不仅是面粉及面制品颜色形成的重要因素，还对其营养价值有很大影响。因此，准确测定面粉中类胡萝卜素的含量对评价小麦营养价值及今后品质育种具有重大的指导意义。

现阶段，对小麦面粉及其面制品颜色的测定还仅局限于对其黄色素含量的测定。黄色素是小麦籽粒中最主要的天然色素，籽粒黄色素含量与面粉及面团黄度的相关系数高达0.8-0.9。利用分光光度计的方法测定面粉中黄色素的含量是评价面粉颜色的重要方法，鉴于人们对于黄色素的深入研究，该方法已经不能满足研究者的要求。类胡萝卜素是黄色素的主要组成部分，是生物体内通过类异戊二烯途径合成而呈现黄色、橙红色和红色的一大类萜类色素物质。要想深入研究黄色素对面粉颜色影响的机理，必须准确测定类胡萝卜素各组分的含量。目前，液相色谱法测定麦类作物中类胡萝卜素含量已有初步研究，但不同研究者方法不尽相同，色谱条件和提取方法是影响测定结果的重要原因。

高压液相色谱(HPLC)技术的进步已经使其成为在复杂的混合物中分离类胡萝卜素的最有效方法，其良好的重现性和灵敏度为分析人员提供了可靠和稳定的数据。用于类胡萝卜素HPLC分析和分离的固定相是多样的，类胡萝卜素分子的特征结构为多聚共轭双烯结构，这使得反相性较强的C₁₈柱成为分离和纯化类胡萝卜素的最具代表性的柱型，在高灵敏度的HPLC上，甚至可以测出样品中痕量类胡萝卜素及其几何异构体。尽管如此，C₁₈柱对类胡萝卜素顺反异构体的分离能力很有限，1994年Sander等应用自行设计的C₃₀柱，首次分离得到类胡萝卜素异构体，并达到非常好的分离效果。在相同的色谱条件下，与用作对照的两种传统的多聚和单聚C₁₈柱相比，C₃₀柱不仅近基线分离出更多的不同极性的类胡萝卜素，还进一步分离出对照柱中无法分开的顺反几何异构体。液相色谱法在蔬菜、水果及其制品中测定其类胡萝卜素含量应用已很广泛，然而，在麦类作物中，对类胡萝卜素含量的测定并没有统一的方法，Hidalgo等利用HPLC测定一粒小麦中叶黄素、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素，色谱柱为GRACE-Vydac 201TP54C₁₈(250×4.6mm，5μm)，流动相选用甲醇：四氢呋喃(95:5，v/v)，此实验结果中叶黄素的峰形中出现杂峰，α-胡萝卜素与β-胡萝卜素两种物质的峰形没有完全分开。Konopka等利用色谱柱YMC-C₃₀(250×4.6mm,3μm)，流动相甲醇：甲叔丁基醚(89:11，v/v)测定波兰春小麦中的类胡萝卜素，其中叶黄素与玉米黄质的分离效果不好，且运行时间较长(1小时)。

随着色谱技术的发展，2004年Waters公司研制出第一批超高效液相色谱(UPLC)，和HPLC相比，它具有更高的灵敏度、分离度和运行速度。Hung等在2011年采用色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C₁₈(100×2.1mm，1.7μm)，以含0.1％三氟乙酸的超纯水(A)和甲醇：乙腈：异丙醇＝54:44:2(v/v/v)(B)为流动相，利用UPLC测定硬粒小麦中的类胡萝卜素，包括叶黄素、番茄红素和β-胡萝卜素，在这个试验中并没有测定玉米黄质和α-胡萝卜素。

小麦中类胡萝卜素的提取方法并不统一，我国对小麦类胡萝卜素的研究几乎为零。很多实验室将黄色素分析与类胡萝卜素等同，参照AACC 14-50，利用水饱和正丁醇提取，分光光度计检测，此方法只能测定面粉的黄度，并不能鉴定其组分。Hung等在对硬粒小麦类胡萝卜素含量的测定实验中，利用水饱和正丁醇提取，不仅提取时间长，而且水饱和正丁醇粘度大，与流动相相容难度大。因此，如何建立快速和高效地提取小麦面粉中类胡萝卜素方法，选取何种提取液，从而提高提取效率，显得尤为重要。

目前，利用UPLC测定类胡萝卜素的研究还很少，国内基本没有，更没有统一的行业测定标准。因此，选择怎样的UPLC的色谱条件才有利于保证实验的准确性和可重复性，需要进一步的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小麦中类胡萝卜素的提取方法。