[发明专利]纳米羟基磷灰石‑基因‑药物复合物及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物及制备方法和应用。

背景技术

近些年，治疗癌症的通用方法是手术，放射治疗和化疗，其中包括诸如阿霉素、紫杉醇、顺铂等在内的化疗药物正在被广泛使用。以阿霉素为例，作为一种光谱的非特异性细胞周期抗癌药物，阿霉素可镶嵌到RNA和DNA上，抑制细胞周期，进而促进肿瘤细胞凋亡。但是，抗肿瘤药物本身存在缺陷：巨大的细胞毒性和严重的副作用，在临床上会对病人带来巨大伤害。

作为一种可治疗基因缺陷疾病的治愈方法，基因治疗已得到快速发展。在多数癌细胞中已发现有肿瘤抑制基因的突变，肿瘤抑制基因的再次引入对癌症的治疗提供了一种可能。例如，野生型p53肿瘤抑制基因在细胞周期调控过程中发挥重要作用。当细胞中的DNA受到损伤时，P53蛋白将结合到受损DNA上，阻止细胞周期运行，进而促使细胞凋亡。在所有恶性肿瘤中，50%以上会出现该基因的突变。将野生型p53基因再次引入到肿瘤细胞中，有可能重启p53凋亡途径，并增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，例如抗肿瘤药物引起的DNA损伤。

为提升肿瘤治疗效果，联合基因治疗和化疗在最近几年受到广泛关注。Wiradharma等使用两亲物寡肽载体来传递p53基因和阿霉素，发现在人肝癌细胞系水平具有联合凋亡效果；Lu等以阳离子β-环糊精-聚乙烯亚胺作为p53基因和阿霉素的共传递载体，发现可增强乳腺癌移植瘤小鼠模型的肿瘤生长抑制作用，并增长小鼠的存活时间。相较于单一的p53基因治疗和单一的阿霉素治疗，以共传输载体介导的联合治疗作用可显著增强癌细胞凋亡。

联合治疗的最大障碍是寻找一种具有高负载率、安全无毒、可穿透细胞膜，并可保护基因和药物完整到达指定细胞部位的共传递载体系统。在现有报道中，多以阳离子β-环糊精-聚乙烯亚胺、mPEG-PLGA-b-PLL、PLGA-PLLA双壁微球、两亲物寡肽等有机复合物作为基因和药物共传递载体，但是这些有机复合物或多或少都可能会对细胞或组织造成毒性，即使在低浓度下。以无极纳米材料作为药物载体在近些年得到迅猛发展。羟基磷灰石作为一种牙齿骨骼重要组成之一，具有包括良好的生物相容性和生物降解性、安全低毒、稳定的化学结构和载药性广等优点，是一种有潜力的基因和药物载体。但是现有的羟基磷灰石基因转染效率不高，制备一种具有高效转染效率的纳米羟基磷灰石尤为重要。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是提供一种以聚乙烯亚胺包裹，能实现抗肿瘤基因和药物的有效转染及其基因和药物在胞内的缓慢释放，且酸敏响应性的纳米羟基磷灰石，并以其作为基因和药物共传递载体，形成纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物及制备方法和应用。本发明制备的纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物可直接用于瘤内注射或静脉注射。

所述的纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物，其特征在于所述复合物由纳米羟基磷灰石、抗肿瘤基因、抗肿瘤药物组成，所述纳米羟基磷灰石尺寸为20-300nm，纳米羟基磷灰石表层由聚乙烯亚胺覆盖，所述基因为抗肿瘤基因，所述药物为抗肿瘤药物。

2、根据权利要求1所述的纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物，其特征在于所述纳米羟基磷灰石表层的聚乙烯亚胺为分枝状，其分子量为8900-120000Da。

所述的纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物，其特征在于所述抗肿瘤基因为野生型p53基因、Rb基因、p16基因、APC基因、MCC基因、DCC基因、MTS基因、PTEN基因中的任一种或几种。

所述的纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物，其特征在于所述抗肿瘤药物为阿霉素、紫杉醇、顺铂、吉西他滨、氟尿嘧啶、盖诺、表阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、博莱霉素、多帕菲或它们的衍生物中的任何一种或几种。

所述的纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1）将钙盐溶液于0-4℃冷却，逐滴加入等体积磷酸盐溶液，并维持100-300rpm/min搅拌，待滴加完成后，持续搅拌0.5-5h；

2）在步骤1）反应体系中缓慢滴加碳酸氢钠溶液，持续搅拌0.5-5h，其中，碳酸氢钠溶液的滴加量为步骤1）中钙盐溶液体积的0.004-0.01倍；

3）用氨水缓慢调节反应体系的pH值至10-13，调节完成后持续搅拌0.5-5h；

4）缓慢滴加与步骤2）中碳酸氢钠溶液等体积的聚乙二醇-400溶液，持续搅拌0.5-5h；

5）将步骤4）反应体系升温至90℃，持续搅拌0.5-5h；