[发明专利]一种甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的检测方法

权利要求书

1.一种甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的检测方法,其特征在于，包括如下步骤：

S1：α-丁酮酸对照品溶液的制备

称取α-丁酮酸，用水配制成0.000025～0.00025mol/L的溶液，作为对照品溶液；

S2：供试品溶液的制备

称取供试品，加酶稀释液、二硫苏糖醇溶液、乙二胺四乙酸溶液、磷酸吡哆醛溶液，配制成供试品溶液；

S3：酶解反应

取至少两支离心管，其中一支离心管编号为N0；向其余各离心管中加入等量的底物溶液和磷酸吡哆醛溶液，并于37℃预热；然后向离心管N0中加入体积为V1的三氯乙酸溶液，同时向其它离心管中各加入体积为V2的供试品溶液，然后将这些离心管置于37℃水浴中反应；反应结束后立即向离心管N0中加入体积为V2的供试品溶液，同时向其它离心管中各加入体积为V1的三氯乙酸溶液，摇匀；将离心管N0作为空白反应液，其余离心管作为酶解反应液；

其中，所述底物溶液为由KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液和L-甲硫氨酸组成的混合溶液；

S4：α-丁酮酸含量的测定

S41：量取步骤S3所得的空白反应液体积为V3置于离心管中，然后加入总体积为V4的乙酸钠溶液和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物溶液，摇匀，备用；

S42：量取步骤S3所得的酶解反应液体积为V3置于离心管中，然后加入总体积为V4的乙酸钠溶液和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物溶液，摇匀，备用；

S43：量取体积为V3的水置于离心管中，然后加入总体积为V4的乙酸钠溶液和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物溶液，摇匀，作为空白对照液，备用；

将上述各离心管放置于50℃水浴中进行反应，然后冷却降温，采用紫外-可见分光光度法，在315～325nm波长处，分别测定空白反应液、酶解反应液、α-丁酮酸对照品溶液的吸光度A0、At、As，并根据如下公式计算反应液中酶的效价：

其中，M为反应常数，M＝2.3C，C为α-丁酮酸对照品溶液的浓度；

F为实际称样量制备的酶液浓度与计算称样量制备的酶液浓度的比值；

取样量为MGL酶的实际称样量。

2.根据权利要求1所述的甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的检测方法，其特征在于，步骤S2中的所述供试品为甲硫氨酸γ-裂解酶或甲硫氨酸γ-裂解酶冻干粉制剂。

3.根据权利要求1所述的甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的检测方法，其特征在于，步骤S2中的所述供试品溶液中酶的配置浓度为0.0575～0.575U/ml。

4.根据权利要求3所述的甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的检测方法，其特征在于，步骤S2中的所述供试品溶液中酶的配置浓度为0.3U/ml，所述M的值为0.345。

5.根据权利要求1或2所述的甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的检测方法，其特征在于，步骤S2中的酶稀释液为pH＝8.0、浓度为100mmol/L的KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液。

6.根据权利要求1或2所述的甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的检测方法，其特征在于，步骤S2中的二硫苏糖醇溶液的质量体积分数为0.01％；乙二胺四乙酸溶液的浓度为1mmol/L；所述磷酸吡哆醛溶液的浓度为0.01mmol/L。

7.根据权利要求1或2所述的甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的检测方法，其特征在于，步骤S3中的KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液为pH＝8.0、浓度为100mmol/L的溶液，所述L-甲硫氨酸的浓度为25mmol/L；所述磷酸吡哆醛的浓度为0.01mmol/L；所述三氯乙酸溶液的质量体积分数为50％。

8.根据权利要求1或2所述的甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的检测方法，其特征在于，步骤S4中的乙酸钠溶液为pH＝5.0、浓度为1mol/L的溶液；所述3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物溶液的质量体积分数为0.1％。