[发明专利]一种甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性检测方法。 

背景技术

甲硫氨酸γ-裂解酶(Methionineγ-lyase；E4.4.1.11)简称MGL，是一种磷酸吡哆醛(PLP)依赖酶，属于γ-蛋白家族。它能催化L-甲硫氨酸的γ-消除反应生成甲硫醇、氨和α-丁酮酸。此外，MGL还能催化L-半胱氨酸及其衍生物的α,β-消除反应及β取代反应。MGL是生物体内甲硫氨酸代谢调控的关键酶，在含硫氨基酸的代谢中发挥着重要的作用。肿瘤细胞对甲硫氨酸的需求非常旺盛，缺乏该氨基酸的情况下多种肿瘤细胞生长停止，而正常的细胞在甲硫氨酸缺乏下仍然正常。有学者在体外细胞培养试验及动物体内试验证明MGL对肺癌、结肠癌、肾癌、等甲硫氨酸依赖性肿瘤具有抗肿瘤作用，并通过Ⅰ期临床试验，证明其具有用于临床的安全性和可靠性。与传统化疗方法相比，MGL作为新型抗肿瘤药物具有肿瘤特异性高，毒副作用小等特点，显示出巨大的临床应用潜力。作为一种极具潜力开发成抗肿瘤药物的酶类，其最重要的酶活力指标的准确测定变得十分重要。 

目前，国内外检测MGL酶活力的方法主要有两种：一是采用检测生成物氨的方法测定酶活，即在MGL作用于底物后产生氨，依据α-酮戊二酸+NH₄⁺+NADH→谷氨酸+NAD⁺反应中NADH的消耗速率与NH₃生成浓度呈正比的原理，利用自动生化监测分析仪直接测定反应液中氨的含量，计算出酶活；二是采用检测生成物α-丁酮酸的方法测定酶活，即在MGL作用于底物产生α-丁酮酸，α-丁酮酸与3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)反应，测定生成物的吸光值，用分光光度法计算α-丁酮酸的量，从而计算酶活。 

直接检测氨的方法测定MGL酶活力，方便省时，但由于本底氨浓度的原因，使测定精度受到影响。试验发现在MGL酶液、底物溶液、水中均含氨，其中以酶液中氨含量相对较高，故测出的酶活力往往偏高。通过检测α-丁酮酸的生成量 来计算酶活的方法，虽较好地解决了本底氨对酶活性测试的干扰，使得测量值比较准确，是目前文献里最通用的MGL酶活测定方法。但是酶活方法本身的影响因素多且复杂，如果仅依据现有文献报道的方法进行酶活测定来进行质量研究，由于没有对照品的参照，显然不能满足药品质量分析中对精密度要求高的方法学要求。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中缺乏对照品、检测方法中精密度低的缺陷，提供了一种甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性检测方法；本发明增加α-丁酮酸作为对照物质，通过方法学的验证，得到了一种精密度高的甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性检测方法。 

一种甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的检测方法,包括如下步骤： 

S1：α-丁酮酸对照品溶液的制备 

称取α-丁酮酸，用水配制成0.000025～0.00025mol/L的溶液，作为对照品溶液； 

S2：甲硫氨酸γ-裂解酶酶供试品溶液的制备 

称取供试品，加酶稀释液、二硫苏糖醇溶液、乙二胺四乙酸溶液、磷酸吡哆醛溶液，配制成供试品溶液； 

S3：酶解反应 

取至少两支离心管，其中一支离心管编号为N0；向其余各离心管中加入等量的底物溶液和磷酸吡哆醛溶液，并于37℃预热；然后向离心管N0中加入体积为V1的三氯乙酸溶液，同时向其它离心管中各加入体积为V2的供试品溶液，然后将这些离心管置于37℃水浴中反应；反应结束后立即向离心管N0中加入体积为V2的供试品溶液，同时向其它离心管中各加入体积为V1的三氯乙酸溶液，摇匀；将离心管N0作为空白反应液，其余离心管作为酶解反应液； 

其中，所述底物溶液为由KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液和L-甲硫氨酸组成的混合溶液； 

S4：α-丁酮酸含量的测定 

S41：量取步骤S3所得的空白反应液体积为V3置于离心管中，然后加入总体积为V4的乙酸钠溶液和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物溶液，摇匀，备用； 

S42：量取步骤S3所得的酶解反应液体积为V3置于离心管中，然后加入总体积为V4的乙酸钠溶液和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物溶液，摇匀，备用； 

S43：量取体积为V3的水置于离心管中，然后加入总体积为V4的乙酸钠溶液和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物溶液，摇匀，作为空白对照液，备用；