[发明专利]一种松材线虫的快速制备方法

权利要求书

1.一种松材线虫的快速制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将葡萄孢接种于PDA培养基上，25℃恒温培养箱中培养7天，待气生菌丝基本长满培养皿时接种松材线虫，每皿接种约200头线虫；将接种后的培养皿置25℃恒温培养箱中培养10-14天，待菌丝基本被线虫消耗完后，置于4℃储存备用；

（2）松材线虫的分离采用贝尔曼漏斗分离法；其装置是将直径10-15cm的玻璃漏斗架在铁架上，下面接一段约10cm的橡皮管，在橡皮管末端接一个1.5ml离心管，橡皮管上装一个弹簧夹；在漏斗内放一个用细铜纱制成的漏斗状网筛，将面巾纸或滤纸裁剪好后放置到漏斗状网筛上，用蒸馏水浸湿滤纸，然后将待分离的培养基材料切碎放置到滤纸上；加水淹没待分离培养基材料，静止分离24h；由于趋水性和自身的重量，线虫就离开培养基材料，沉降到漏斗底部的离心管中；关闭弹簧夹，取下离心管，将管中收集到的线虫转移至另一离心管中，备用；

（3）将收集到的松材线虫及虫卵进行消毒处理。

2.根据权利要求1所述一种松材线虫的快速制备方法，其特征在于所述消毒处理方法包括以下步骤：

1）收集到的松材线虫分别用无菌的M9溶液洗涤，离心1min；

2）用1%的硫柳汞溶液消毒，无菌水洗涤3次；

3）用硫酸链霉素和放线菌酮，4℃消毒过夜；

4）无菌水冲洗后回接到长到半皿的灰葡萄孢菌上，培养1-2天，时刻观察，待有少量虫卵产生时，无菌水冲洗收集线虫；

5）将重新收集的线虫用无菌的M9溶液洗涤，离心1min；

6）重复步骤2）；

7）将6）中消毒的线虫放在装有无菌的生理盐水的培养皿中，25℃生化培养箱中培养，待大量虫卵产生后收集虫卵；

8）用无菌水冲洗培养皿，直至线虫去除干净，只剩皿底的虫卵；

9）用吐温和NaOH溶液收集虫卵；

10）无菌水冲洗；

11）将部分虫卵置于NA培养基上，检测消毒情况，其余的虫卵接种到长满灰葡萄孢的斜面上。

3.根据权利要求2所述一种松材线虫的快速制备方法，其特征在于所述消毒处理方法包括以下步骤：

1）收集到的松材线虫分别用无菌的M9溶液洗涤3-4次，3000rpm离心1min；

2）用1%的硫柳汞溶液消毒30min，无菌水洗涤3次；

3）用0.1%的硫酸链霉素和0.02%的放线菌酮，4℃消毒过夜；

4）无菌水冲洗3次后回接到长到半皿的灰葡萄孢菌上，培养1-2天，时刻观察，待有少量虫卵产生时，无菌水冲洗收集线虫；

5）将重新收集的线虫用无菌的M9溶液洗涤3-4次，3000rpm离心1min；

6）重复步骤2）；

7）将6）中消毒的线虫放在装有无菌的0.9%的生理盐水的培养皿中，25℃生化培养箱中培养12-24h，待大量虫卵产生后收集虫卵；

8）用无菌水冲洗培养皿，直至线虫去除干净，只剩皿底的虫卵；

9）用0.05%的吐温和8mM的NaOH溶液收集虫卵；

10）无菌水冲洗5次；

11）将部分虫卵置于NA培养基上，检测消毒情况，其余的虫卵接种到长满灰葡萄孢的斜面上。