[发明专利]一种松材线虫的快速制备方法

说明书

技术领域

本发明属于线虫制备技术领域，尤其涉及一种松材线虫的快速制备方法。

背景技术

我国于1982年在南京中山陵首次发现松材线虫病，此后，该病在我国境内迅速扩散蔓延，危害日趋严重，现已在江苏、浙江、安徽、福建、江西、山东、河南、湖北、湖南、广东、广西、重庆、四川、贵州、陕西、香港及台湾等地区发生，发生面积达8.7万公顷，累计致死松树3,500多万株,因松材线虫病造成的直接经济损失已达25亿元，间接损失达250亿，使我国的松木资源、自然景观和生态环境遭受严重影响。

发明内容

本发明就是针对上述问题，提供一种灵敏、快速的松材线虫的快速制备方法。

为实现上述目的，本发明包括以下步骤。

（1）将葡萄孢接种于PDA培养基上，25℃恒温培养箱中培养7天，待气生菌丝基本长满培养皿时接种松材线虫，每皿接种约200头线虫。将接种后的培养皿置25℃恒温培养箱中培养10-14天，待菌丝基本被线虫消耗完后，置于4℃储存备用。

（2）松材线虫的分离采用贝尔曼漏斗分离法；其装置是将直径10-15cm的玻璃漏斗架在铁架上，下面接一段约10cm的橡皮管，在橡皮管末端接一个1.5ml离心管，橡皮管上装一个弹簧夹；在漏斗内放一个用细铜纱制成的漏斗状网筛，将面巾纸或滤纸裁剪好后放置到漏斗状网筛上，用蒸馏水浸湿滤纸，然后将待分离的培养基材料切碎放置到滤纸上；加水淹没待分离培养基材料，静止分离24h；由于趋水性和自身的重量，线虫就离开培养基材料，沉降到漏斗底部的离心管中；关闭弹簧夹，取下离心管，将管中收集到的线虫转移至另一离心管中，备用。

（3）将收集到的松材线虫及虫卵进行消毒处理。

作为一种优选方案，本发明所述消毒处理方法包括以下步骤。

1）收集到的松材线虫分别用无菌的M9溶液洗涤，离心1min。

2）用1%的硫柳汞溶液消毒，无菌水洗涤3次。

3）用硫酸链霉素和放线菌酮，4℃消毒过夜。

4）无菌水冲洗后回接到长到半皿的灰葡萄孢菌上，培养1-2天，时刻观察，待有少量虫卵产生时，无菌水冲洗收集线虫。

5）将重新收集的线虫用无菌的M9溶液洗涤，离心1min。

6）重复步骤2）。

7）将6）中消毒的线虫放在装有无菌的生理盐水的培养皿中，25℃生化培养箱中培养，待大量虫卵产生后收集虫卵。

8）用无菌水冲洗培养皿，直至线虫去除干净，只剩皿底的虫卵。

9）用吐温和NaOH溶液收集虫卵。

10）无菌水冲洗。

11）将部分虫卵置于NA培养基上，检测消毒情况，其余的虫卵接种到长满灰葡萄孢的斜面上。

作为另一种优选方案，所述消毒处理方法包括以下步骤。

1）收集到的松材线虫分别用无菌的M9溶液洗涤3-4次，3000rpm离心1min。

2）用1%的硫柳汞溶液消毒30min，无菌水洗涤3次。

3）用0.1%的硫酸链霉素和0.02%的放线菌酮，4℃消毒过夜。

4）无菌水冲洗3次后回接到长到半皿的灰葡萄孢菌上，培养1-2天，时刻观察，待有少量虫卵产生时，无菌水冲洗收集线虫。

5）将重新收集的线虫用无菌的M9溶液洗涤3-4次，3000rpm离心1min。

6）重复步骤2）。

7）将6）中消毒的线虫放在装有无菌的0.9%的生理盐水的培养皿中，25℃生化培养箱中培养12-24h，待大量虫卵产生后收集虫卵。

8）用无菌水冲洗培养皿，直至线虫去除干净，只剩皿底的虫卵。

9）用0.05%的吐温和8mM的NaOH溶液收集虫卵。

10）无菌水冲洗5次。

11）将部分虫卵置于NA培养基上，检测消毒情况，其余的虫卵接种到长满灰葡萄孢的斜面上。

本发明有益效果。

本实验采用PCR方法检测消毒效果可弥补传统培养方法的缺点，结合对线虫和虫卵进行多步消毒的方法，建立了获得无菌线虫的技术。与传统培养检测的方法相比，PCR方法检测细菌污染更灵敏更快速。

具体实施方式

本发明包括以下步骤。

（1）将葡萄孢接种于PDA培养基上，25℃恒温培养箱中培养7天，待气生菌丝基本长满培养皿时接种松材线虫，每皿接种约200头线虫。将接种后的培养皿置25℃恒温培养箱中培养10-14天，待菌丝基本被线虫消耗完后，置于4℃储存备用。