[发明专利]一种菌丝生长活性测定方法

说明书

技术领域

本发明属于活性测定方法技术领域，尤其涉及一种菌丝生长活性测定方法。

背景技术

对候选化合物进行有效、快速、灵敏的抗菌活性评价是杀菌剂筛选和研发中的重要环节，针对抗细菌和抗真菌活性成分的筛选，目前常用的抗菌活性测定方法主要有：药剂扩散法（如打孔药剂扩散法、滤纸片法、杯碟法）、生长速率法（如带毒平板法、液体悬浮培养法、多孔板比浊度法）、孢子萌发法、通过检测细胞酶活性的分光光度法等，这些方法各具优点，同时也存在一定的局限性。

发明内容

本发明就是针对上述问题，提供一种操作简单、测定可靠的菌丝生长活性测定方法。

为实现上述目的，本发明包括以下步骤。

取一定量母液于PDA培养基中，充分混合，将混合好的培养基均匀倒入培养皿内冷凝即成带毒培养基。待培养基冷却凝固后，用接种针或消毒的镊子将制备好的菌饼反面移植到带毒培养基上。设阴性对照、空白对照和阳性对照。

液体悬浮培养在活性测定之前确定供试病原真菌在液体悬浮培养中的最佳收获期，挑取新鲜菌丝于无菌马铃薯-葡萄糖-液体培养基中，同时含有相应的有机溶剂，摇床培养，，采用过滤法收集菌丝，烘干至恒重，求其平均值，在此基础上绘制菌丝生长曲线，将供试样品用合适的溶剂配成系列浓度的母液，然后取一定量于真菌培养液中。

用接种针将制备好的菌饼挑到混合好的带毒PDB培养液中。然后摇床培养，待菌丝生长到最佳收获期时，采用过滤法收集菌丝，烘干菌丝至恒重。实验设阴性对照、空白对照和阳性对照。

作为一种优选方案，本发明所述取一定量母液于PDA培养基中，充分混合，化合物在培养液中的浓度分别为：256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL和8μg/mL；将混合好的培养基均匀倒入培养皿内冷凝即成带毒培养基；待培养基冷却凝固后，用接种针或消毒的镊子将制备好的菌饼反面移植到带毒培养基上，1个培养皿中央接1个菌饼；设阴性对照、空白对照和阳性对照，每个处理重复3次。

作为另一种优选方案，本发明所述液体悬浮培养在活性测定之前确定3种供试病原真菌在液体悬浮培养中的最佳收获期，挑取新鲜菌丝于无菌马铃薯-葡萄糖-液体培养基中，同时含有相应的1%的有机溶剂，摇床培养5-8天，每天取出3瓶，采用过滤法收集菌丝，于60°C下烘干至恒重，求其平均值，在此基础上绘制菌丝生长曲线，将供试样品用合适的溶剂配成系列浓度的母液：2.0mg/mL、1.5mg/mL、1.0mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL和0.0625mg/mL，然后取一定量于真菌培养液中，在培养液中的浓度分别为：20μg/mL、15μg/mL、10μg/mL、5.0μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL。

用接种针将制备好的菌饼挑到混合好的带毒PDB培养液中，1个三角瓶中接种1个菌饼；然后摇床培养，待菌丝生长到最佳收获期时，采用过滤法收集菌丝，于60°C下烘干菌丝至恒重；实验设阴性对照、空白对照和阳性对照，每个处理重复3次。

本发明有益效果。

本发明测定菌丝在固体培养基上生长，菌丝的生长速度一般是以菌落扩展的直径来间接衡量；操作比较简单，对抗菌化合物的主要剂型都很适合，重现性好，便可得到可靠的结果。

具体实施方式

本发明包括以下步骤。

取一定量母液于PDA培养基中，充分混合，将混合好的培养基均匀倒入培养皿内冷凝即成带毒培养基；待培养基冷却凝固后，用接种针或消毒的镊子将制备好的菌饼反面移植到带毒培养基上；设阴性对照、空白对照和阳性对照。

液体悬浮培养在活性测定之前确定供试病原真菌在液体悬浮培养中的最佳收获期，挑取新鲜菌丝于无菌马铃薯-葡萄糖-液体培养基中，同时含有相应的有机溶剂，摇床培养，，采用过滤法收集菌丝，烘干至恒重，求其平均值，在此基础上绘制菌丝生长曲线，将供试样品用合适的溶剂配成系列浓度的母液，然后取一定量于真菌培养液中。

用接种针将制备好的菌饼挑到混合好的带毒PDB培养液中；然后摇床培养，待菌丝生长到最佳收获期时，采用过滤法收集菌丝，烘干菌丝至恒重；实验设阴性对照、空白对照和阳性对照。