[发明专利]一种Rv2645蛋白的制备及其在结核诊断与重组BCG疫苗中的应用

说明书

技术领域

本发明属于分子微生物学和感染免疫学领域，涉及一种Rv2645蛋白的制备及其在结核诊断与重组BCG疫苗中的应用。

背景技术

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)导致的结核病(Tuberculosis,TB)是一种流行广、危害大的传染病，与艾滋病、疟疾并称为世界三大传染病。全球有三分之一的人感染过结核病，每年死于结核病者有170多万人，为防治TB耗去大量人力、物力。

长期以来，结核病的诊断依赖于结核菌素皮肤实验，但是这种方法不能用于区分结核病患者及接种过结核疫苗BCG的健康人。痰培养虽然是结核诊断的金标准，但是其培养周期长，至少需要一个星期获取结果，而且该实验必须在严格的生物安全实验室里进行。痰涂片的抗酸染色虽然简单易行，但是其灵敏度低(约34％检出率)。唯一获准用于预防结核病、并广泛使用的疫苗是减毒的牛分枝杆菌制备的卡介苗(BCG，bacillus Calmette-Gue′rin)。多年实践表明，BCG仅对儿童有一定保护作用，对成年人保护效果差异很大，其预防作用从0％～80％不等，这一传统疫苗的效果受到严峻挑战。BCG是从20世纪60年代开始通过培养的方法进行传代和保存的。反复传代使BCG一些重要的免疫保护性抗原基因发生变化，当年有效预防肺结核的BCG菌株已不复存在。Behr等(Behr MA,Wilson MA,Anderson P,et al.Comparative genomic of BCG vaccines by whole genome DNA microarray[J].Sciernce,1996,284(541):1520-1523)用基因芯片技术发现BCG较M.tb缺失了RD1-RD16(regions of difference,RD)这16个基因区域。近年来许多研究报道显示，恰恰是这些丢失区域所表达的蛋白具有很强的免疫原性。譬如，RD1区基因中广为报道的丢失基因ESAT-6，该基因所表达蛋白已被证实具有很强的免疫原性。后续的研究证实，通过电转技术将ESAT-6基因插入BCG基因组后能增强免疫保护作用，这一研究已发表在Nature(Pym AS，Brodin P,Mailessi L,et al.Recombinant BCG exporting ESAT-6confers enhanced protection against tuberculosis.Nature,2003,5,9(5):533-9.)上。但该研究仅限于RD1区，其他RD区可能亦存在类似于ESAT-6或更强于ESAT-6的优势抗原。但由于RD1-16基因数众多，使得该研究较为困难。

发明内容

本发明的第一目的在于筛选并制备出结核杆菌RD10-14区中的优势抗原蛋白。

本发明的第二目的在于评价筛选出的RD13区的优势目的抗原Rv2645蛋白在结核病诊断中的应用价值。通过ELISA抗体夹心法，检测健康人与结核病人在Rv2645抗原特异性抗体IgG、IgM、IgG2、IgG4上的差异。进一步筛选出Rv2645用于结核病临床诊断时最具特异性的抗体亚型。

本发明的第三目的在于评价优势目的抗原Rv2645在结核病疫苗研究中的潜力及应用价值，特别是用于重组BCG的抗结核保护性效果。

为实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：

本发明研究内容是采用经典分子生物克隆技术，从GenBank中查RD区(RD10-14)基因序列，设计引物并从M.tb菌株H37Rv(ATCC 25618)基因组中PCR得到RD区PCR产物，将PCR产物构建到His标签的原核表达载体pET28a(Invitrogen)上，重组成功的质粒转化蛋白表达工程菌大肠杆菌-BL21(Invitrogen)，利用IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导及Ni-NTA(琼脂糖-镍珠)亲和纯化获取表达纯化蛋白，并通过BSA(牛血清蛋白)制作标准曲线的Bradford方法测量各纯化蛋白的浓度。