[发明专利]一种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP引物、试剂盒及方法

权利要求书

1.一种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP引物，其特征在于：包括以下2对引物：外引物F3和B3以及内引物FIP和BIP；FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

2.一种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括40μmol·L^-1的FIP 1.0μL，40μmol·L^-1的BIP 1.0μL，10μmol·L^-1的F3 0.5μL以及10μmol·L^-1的B3 0.5μL；F3和B3为外引物，FIP和BIP为内引物，FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

3.如权利要求2所述一种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括2×反应缓冲液12.5μL，8U/μL Bst聚合酶1μL，25mM dNTP 1.5μL以及荧光染料1μL。

4.如权利要求3所述一种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP试剂盒，其特征在于：所述荧光染料为质量分数0.5％的钙黄绿素水溶液。

5.一种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)提取待检测对象的DNA；

2)将以下组份进行混合，构建包括2对引物F3和B3以及FIP和BIP的25μL LAMP反应体系：

2×反应缓冲液12.5μL，40μmol·L^-1的FIP 1.0μL，40μmol·L^-1的BIP 1.0μL，10μmol·L^-1的F3 0.5μL，10μmol·L^-1的B3 0.5μL，8U/μL Bst聚合酶1μL，25mMdNTP 1.5μL，待检测对象的DNA 2μL，荧光染料1μL，超纯水补足至25μL；FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示；

3)将LAMP反应体系在63℃加热40min，然后在85℃加热5min，反应完成；

4)待反应完成后通过以下方式进行结果的判定：

反应完成后观察LAMP反应体系是否有颜色的变化，若LAMP反应体系颜色发生变化则为阳性反应，表明在待检测对象中检测到肺炎克雷伯氏菌；若LAMP反应体系颜色未发生变化则为阴性反应，表明在待检测对象中未检测到肺炎克雷伯氏菌。

6.如权利要求5所述一种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP方法，其特征在于：所述待检测对象的DNA的提取方法为：

将待检测对象的血液、组织液或化脓液接种于肉汤培养基中，然后在37℃条件下培养24h得菌液，取菌液离心，将离心得到的上清用DNA试剂盒提取DNA。

7.如权利要求5所述一种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP方法，其特征在于：在检测时还分别设立阳性对照和阴性对照，以肺炎克雷伯氏菌基因组DNA为阳性对照，以超纯水为阴性对照；在进行结果的判定时，还与阳性对照和阴性对照比较，若待检测对象所对应的LAMP反应体系以及阳性对照所对应的LAMP反应体系均呈绿色，则判定待检测对象的检测结果为阳性反应，若待检测对象所对应的LAMP反应体系以及阴性对照所对应的LAMP反应体系均呈橘黄色，则判定待检测对象的检测结果为阴性反应。