[发明专利]一种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP引物、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于医学微生物检测技术领域，涉及一种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP引物及检测方法。

背景技术

肺炎克雷伯氏菌为革兰氏阴性、不运动型、有荚膜、乳酸发酵、兼性厌氧的杆状细菌。肺炎克雷伯氏菌通常寄居在大小鼠和其他动物的肠道。作为机会致病菌，肺炎克雷伯氏菌一旦进入呼吸道，即可感染大小鼠，造成严重肺部损伤，并且该菌在耐抗生素裸鼠中有取代其他细菌的更强的生长趋势，为实验用啮齿动物的常见健康监控指标之一。

目前常用的肺炎克雷伯氏菌检测方法包括使用监测拭子直接铺板法及显色培养基法和常规PCR法/荧光定量PCR法，均可以有效地检测。但细菌培养法较其他方法存在难以标准化、耗时长，培养基、操作步骤或培养条件在不同实验室差别较大等缺点，故结果可能不一致或出现假阴/阳性。常规PCR法和荧光定量PCR法，需经过变性、退火、延伸，加上DNA提取整个过程大概需要2～4个小时才能出结果，并且需要精密昂贵的仪器和试剂，对基层开展快速简便的分子诊断不利。

Notomi等人于2000年发明环介导等温扩增(LAMP)技术，经过逐步改进，该技术借助6条特异性引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，可在等温条件下快速、高特异和灵敏的扩增靶序列。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP引物、试剂盒及方法。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP引物，包括以下2对引物：外引物F3和B3以及内引物FIP和BIP；FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

一种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP试剂盒，该试剂盒包括40μmol.L^-1的FIP 1.0μL，40μmol.L^-1的BIP 1.0μL，10μmol.L^-1的F30.5μL以及10μmol.L^-1的B30.5μL；F3和B3为外引物，FIP和BIP为内引物，FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

所述试剂盒还包括2×反应缓冲液12.5μL，8U/μL Bst聚合酶1μL，25mM dNTP 1.5μL以及荧光染料1μL。

所述荧光染料为质量分数0.5％的钙黄绿素水溶液。

一种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP方法，包括以下步骤：

1)提取待检测对象(例如大鼠、小鼠)的DNA；

2)将以下组份进行混合，构建包括2对引物F3和B3以及FIP和BIP的25μL LAMP反应体系：

2×反应缓冲液12.5μL，40μmol.L^-1的FIP 1.0μL，40μmol.L^-1的BIP 1.0μL，10μmol.L^-1的F30.5μL，10μmol.L^-1的B30.5μL，8U/μL Bst聚合酶1μL，25mM dNTP 1.5μL，待检测对象的DNA 2μL，荧光染料1μL，超纯水补足至25μL；FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示；

3)将LAMP反应体系在63℃加热40min，然后在85℃加热5min，反应完成；

4)待反应完成后通过以下方式进行结果的判定：

反应完成后观察LAMP反应体系是否有颜色的变化，若LAMP反应体系颜色发生变化则为阳性反应，表明在待检测对象中检测到肺炎克雷伯氏菌；若LAMP反应体系颜色未发生变化则为阴性反应，表明在待检测对象中未检测到肺炎克雷伯氏菌。

所述待检测对象的DNA的提取方法为：

将待检测对象的血液、组织液或化脓液接种于肉汤培养基中，然后在37℃条件下培养24h得菌液，取菌液离心，将离心得到的上清用DNA试剂盒提取DNA。