[发明专利]一种利用静息乳酸菌技术转化菜油脚料生产共轭亚油酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用农产品废弃物菜油脚料为原料，采用静息乳酸菌技术生产共轭亚油酸的方法。

背景技术

目前共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid，CLA）的制备多采用化学法，该法是以价格为3 万/T 的红花油或葵花油为原料，采用高温、高压、碱法异构化使油中的亚油酸发生异构化而生成共轭亚油酸，其缺点是成本高，且合成时产生的t，t 异构体对人体有害。微生物细胞发酵法生产CLA，是以食用油为生产原料，微生物（如乳酸菌属、真杆菌属、丁酸弧菌属等）为生产用菌株，虽然成本较低、生物稳定性好，但是存在菌种很难达到高密度转化、生长周期长、易染菌、产物复杂等问题。 

静息细胞转化生产CLA技术具有以下优点：（1）细胞处于休眠状态，可以作为亚油酸异构酶的天然透析袋，免去了酶提取纯化的繁琐过程和高额成本，产物CLA以游离形式积累在细胞外，易于提取；(2)生成的反应产物是具有生理活性的c9,t11-CLA和t10,c12-CLA；(3) 反应只需在适宜的介质体系条件下进行，转化产物单一，CLA能以高浓度积累；(4) 静息细胞可以达到很高的密度，比发酵法的细胞密度高出十多倍。

我国是世界上最大的油菜籽生产国，年产量早已突破1000万吨，在菜籽油加工过程中，油脚料每年排放量高达20万吨之多。油脚极易发酵变质、酸败发臭，是我国城镇油厂环境污染的重要源头。菜油脚料中含有25%-30%的中性油，25%-35%的磷脂，其余为蛋白质、氨基酸，糖等碳水化合物，矿质元素及色素等物质，所以油脚的利用开发成为环境治理和生物资源再利用的研究热点。目前菜油脚料主要用来制备生物柴油、饲料、农业肥料等，而从中提取中性脂肪酸，并进一步加工转化获得高附加值产品CLA，却极为少见。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种利用静息乳酸菌实现农产品废弃物菜油脚料转化生产共轭亚油酸（CLA）的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的。

本发明工艺步骤包括。

（1）提取油脂：称取菜油脚料到烧杯中，放在水浴锅中60-90℃搅拌加热20-40 min，期间加入少量微沸蒸馏水；将热处理后的菜油脚料4000-6000 rpm离心10-30 min，离心后上层为油层（中性油脂），中层为水层，下层为磷脂等杂质固体，倾出上层油，即为菜油脚料中所提取的中性油脂。

（2）乳化：将步骤（1）得到的中性油脂与Tween 80按照1:0.8-1.7比例混合，加入适量的蒸馏水，进行超声波乳化处理（500 W，超声10 s，间歇5 s，作用10-20次），110-121℃灭菌20-30 min，得油脂乳化液。

（3）酶解：取步骤（2）的油脂乳化液放入锥形瓶中，加入pH值7.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，添加黑曲霉脂肪酶粉至终浓度为150-270 U/mL，40-45℃，120-150 rpm酶解30-50 min，得油脂酶解液。

（4）制备静息乳酸菌：从新鲜斜面培养基上挑取乳酸菌，接种到MRS培养基中，37℃厌氧培养20-26 h，得种子液。将种子液按3%-5%的接种量接种至添加有亚油酸乳化液的MRS培养基中进行诱导增殖培养，37℃静置培养20 h；培养液4℃，4000-6000 rpm离心15-30 min，去除上清液，底部菌体用无菌生理盐水洗涤2-3次，离心收集，制备静息乳酸菌菌悬液。

（5）静息乳酸菌转化菜油脚料提取油脂酶解液生成CLA：取步骤（3）的油脂酶解液放入反应管，加入步骤（4）的静息乳酸菌菌悬液，加入适量0.1 mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，使得提取油脂终浓度为70-80 mg/mL，32-36℃，90-110 rpm转化22-26 h，得CLA转化液。

（6）CLA的提取：取步骤（5）的CLA转化液与正己烷按1:2-5的比例混合，快速混匀4-6 min，3800 -5000 rpm离心4-6min，分为三层（脂相、乳化层和水相），去除最下层水相，然后加入适量蒸馏水，混匀4-6 min，洗涤水溶性物质，离心分层去除下层水相，将脂相层通过无水硫酸钠过滤，旋转蒸发去除正己烷即得到CLA。

本发明可实现农产品废弃物菜油脚料的资源化利用，具有原料成本低，转化细胞密度高，转化效率高（转化率可达20％-40％），转化过程不易染菌，干扰物质少，产物易分离等优点。

附图说明

图1为本发明实施例中乳酸菌转化萃取液和提取油脂的紫外光谱扫描图。

具体实施方式