[发明专利]一种促肝细胞生长素的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及促肝细胞生长素制备技术领域，尤其涉及一种促肝细胞生长素的制备方法。

背景技术

促肝细胞生长素是从新鲜乳猪肝脏中提取的小分子量多肽类混合物，分子量在10000以下。其药理作用主要为可刺激正常肝细胞DNA的合成，促进肝细胞再生，对损伤的肝细胞有保护作用，促进肝功能的恢复，还有调节机体的免疫功能和抗肝纤维化作用。临床上用于治疗重型肝炎、慢性活动性肝炎和肝硬化等。目前，针对促肝细胞生长素这一生物制剂类药物，已经有很多专利和文献报道。

在专利ZL03116052.2中，公开了一种促肝细胞生长素注射液及制备方法，其中的肝细胞生长素为从乳猪中提取分离获得的一种活性蛋白质，占总蛋白含量的60％以上，该促肝细胞生长素是通过以下方法制备：1)匀浆；2)搅拌：加提取液，室温下低速60rpm搅拌1h；3)加热：水浴加热提取罐，液体温度达到95℃时停止加热，保持15-20分钟；4)过滤；5)提纯：将过滤液上样至DEAE SepharoseFF柱中，采用含有氯化钠的PBS溶液进行洗脱，再用超滤膜除盐。该制备方法的工艺繁琐，还需要加盐的洗脱液洗脱后再脱盐，这些操作步骤都会损失活性物质的含量，造成提取物活性低，提取率低。

发明内容

基本背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种促肝细胞生长素的制备方法，采用酶解和超滤工艺，整个工艺简单温和，而且节能环保，提取率高；所制备的促肝细胞生长素的活性较高，并且分子量小于6000D，安全性高，对人的过敏反应基本消除。

本发明提出的一种促肝细胞生长素的制备方法，包括如下步骤：

S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净，沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状，再置于绞肉机中绞成粒径为1-3mm的乳猪肝颗粒；

S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以2800-3000rpm的转速研磨2.5-4.5min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为1-2:1-2加入搅拌机中，以280-300rpm的转速搅拌15-18min得到乳猪肝匀浆；

S3、酶解：将S2得到的乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加3-5mol/L盐酸溶液至pH值为2.5-3.0，再加入胃蛋白酶以150-180rpm的转速搅拌22-25min后，将反应容器及其内容物置于37-45℃的水浴锅中水解6-8h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为99-101:0.4-0.6；

S4、灭活：将S3得到的酶解物料水浴加热至81-82℃，保温10-13min后，将温度降至室温静置得到灭活匀浆；

S5、离心：将S4得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以3700-4200rpm的转速离心13-17min后，将上清液取出滴加3-5mol/L氢氧化钠溶液至pH为6.8-7.2得到中性离心液；

S6、粗滤：将S5得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再经过截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到粗滤液，其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为0.05-0.10MPa；

S7、超滤：将S6得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.15-0.20MPa，回流压力为0.05-0.10MPa。

优选地，S2中，将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以2850-2900rpm的转速研磨3-4min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为1-1.2:1-1.2加入搅拌机中，以290-300rpm的转速搅拌16-17min得到乳猪肝匀浆；

优选地，S3中，将S2得到的乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加4-5mol/L盐酸溶液至pH值为2.7-3.0，再加入胃蛋白酶以160-180rpm的转速搅拌23-25min后，将反应容器及其内容物置于40-42℃的水浴锅中水解6.5-7.5h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为99-101:0.5。

优选地，S5中，将S4得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以3900-4100rpm的转速离心14-16min后，将上清液取出滴加4-5mol/L氢氧化钠溶液至pH为6.9-7.1得到中性离心液。

优选地，S7中，将S6得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.17-0.18MPa，回流压力为0.06-0.09MPa。

优选地，包括如下步骤：