[发明专利]一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法

权利要求书

1.一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法，包括以下步骤：

⑴将油菜及其近缘植物干种子0.5 ~1g置于研钵中，用研棒压破，加几颗石英砂后用力粗研成粉末，然后再加入500~700 μL提取液，迅速用力研磨成匀浆；所述提取液是按下述方法制得：

①将1.2114 g Tris加蒸馏水溶解，并定容至100 mL，即得0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液；

②吸取浓度为10~14 mol/L分析纯盐酸0.85 mL，加水至100mL，混匀后用0.1 mol/L标准氢氧化钠溶液滴定，即得0.1mol/L 盐酸；

③将50 mL所述0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液与29.2mL所述0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100 mL，即得pH =8.0的0.05mol/L Tris-HCl 缓冲液；

④将14.61g EDTA和4g氢氧化钠加水溶解，并定容至100 mL，即得0.5 mol/L乙二胺四乙酸溶液；

⑤分别将10~20g十六烷基三乙基溴化铵、1~3g二硫苏糖醇、1~2g PEG8000用水溶解，然后将该三种溶液混合，得到混合液；

⑦在所述混合液中依次加入90~100 mL所述0.05mol/L Tris-HCl 缓冲液、40~50mL 所述0.5 mol/L乙二胺四乙酸溶液，并加水定容至500mL即得；

⑵所述匀浆装入2 mL 的离心管中，并置于65 ℃水浴中保温15~20 min， 每间隔5 min轻轻摇动离心管1次，以充分裂解；

⑶将所述步骤⑵所得的离心管采用冰浴冷却后，加入500~700 μL氯仿-异戊醇，混匀至不分层，以10000~12000 r/min的速率离心5 min，得到上清液A；

⑷在300~400 μL所述上清液A中加入150~200 μL、3mol/L 的NaCl，摇匀后加入700~800 μL预冷无水乙醇，冰浴静置5~10 min，然后在温度为4℃的条件下以10000~12000 r/min的速率离心5~8 min，得到沉淀物A；

⑸在所述沉淀物A中加入300~400μL、1 mol/L 的NaCl，待所述沉淀物溶解后再加入300~400 μL氯仿-异戊醇，轻轻混匀至不分层，然后在温度为4℃的条件下以10000~12000 r/min的速率离心5 min，得到上清液B；

⑹在300~400μL所述上清液B中依次加入30~40μL、1 mol/L 的NaCl和800~900 μL预冷无水乙醇，冰浴静置5~10 min，然后在温度为4℃的条件下以10000~12000 r/min的速率离心5 min，得到沉淀物B；

⑺所述沉淀物B中加入体积浓度为70~75%的乙醇300~400 μL，洗涤沉淀2~3次后自然风干该沉淀物B，然后加入50~100μL、 pH=8的TE 缓冲液进行充分溶解，即得DNA 提取液。

2.如权利要求1所述的一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法，其特征在于：所述步骤⑴中油菜及其近缘植物干种子是指甘蓝型油菜种子、白菜型油菜种子、芥菜型油菜种子、青海白芥种子以及和田芸芥种子中的任意一种。

3.如权利要求1所述的一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法，其特征在于：所述步骤⑶和所述步骤⑸中的氯仿-异戊醇是指将氯仿与异戊醇按24mL：1 mL的体积比混合而成的混合物。