[发明专利]一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物分子生物学研究的技术领域，尤其涉及一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法。

背景技术

甘肃河西地区气候属高原寒冷半湿润气候，昼夜温差大，日照充足，有利于油菜脂肪的形成和积累，油菜籽出油率达42%以上。民乐、山丹两县是河西油菜主产区，也是甘肃最大的油菜连片种植示范基地，种植面积最大时达44万多亩，是发展优质油菜的理想地带。该地区油菜在增加当地人民收入方面起到了积极作用。

目前，存在的主要问题是：①随着油菜品种数量日益增加，遗传基础相对狭窄，使得完全根据形态性状进行油菜品种的鉴别越来越困难，给种子生产、经营、管理和维权等环节带来不同程度的困难，导致油菜品种多、乱、杂的现象日益突出，对产量和品质造成了严重的影响。②至今，用于油菜品种纯度鉴定，遗传多样性分析的技术主要是SSR和RAPD标记技术，而应用这两大技术的关键环节是基因组DNA的有效提取。多数研究者以幼嫩的组织如新鲜叶片提取基因组DNA，但在实际操作中，为得到幼嫩组织，必须在实验室条件下播种或者田间取材，播种油菜或田间取材耗费大量的人力物力和时间。③三大类型油菜籽、芸芥籽、白芥籽中均贮藏较多的蛋白质和淀粉，采用一般的方法，如CTAB法、SDS法，提取的DNA往往内含杂质（蛋白质、多糖），影响后续的种子纯度鉴定或遗传多样分析等工作。同时，油菜籽中还含有小分子次生物质，如黄酮、香豆素、鞣质等，其中含有酚羟基的化合物，氧化后要与DNA结合，引起DNA降解。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种简便实用的油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法。

为解决上述问题，本发明所述的一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法，包括以下步骤：

⑴将油菜及其近缘植物干种子0.5 ~1g置于研钵中，用研棒压破，加几颗石英砂后用力粗研成粉末，然后再加入500~700 μL提取液，迅速用力研磨成匀浆；所述提取液是按下述方法制得：

①将1.2114 g Tris加蒸馏水溶解，并定容至100 mL，即得0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液；

②吸取浓度为10~14 mol/L分析纯盐酸0.85 mL，加水至100mL，混匀后用0.1 mol/L标准氢氧化钠溶液滴定，即得0.1mol/L 盐酸；

③将50 mL所述0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液与29.2mL所述0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100 mL，即得pH =8.0的0.05mol/L Tris-HCl 缓冲液；

④将14.61g EDTA和4g氢氧化钠加水溶解，并定容至100 mL，即得0.5 mol/L乙二胺四乙酸溶液；

⑤分别将10~20g十六烷基三乙基溴化铵、1~3g二硫苏糖醇、1~2g PEG8000用水溶解，然后将该三种溶液混合，得到混合液；

⑦在所述混合液中依次加入90~100 mL所述0.05mol/L Tris-HCl 缓冲液、40~50mL 所述0.5 mol/L乙二胺四乙酸溶液，并加水定容至500mL即得；

⑵所述匀浆装入2 mL 的离心管中，并置于65 ℃水浴中保温15~20 min， 每间隔5 min轻轻摇动离心管1次，以充分裂解；

⑶将所述步骤⑵所得的离心管采用冰浴冷却后，加入500~700 μL氯仿-异戊醇，混匀至不分层，以10000~12000 r/min的速率离心5 min，得到上清液A；

⑷在300~400 μL所述上清液A中加入150~200 μL、3mol/L 的NaCl，摇匀后加入700~800 μL预冷无水乙醇，冰浴静置5~10 min，然后在温度为4℃的条件下以10000~12000 r/min的速率离心5~8 min，得到沉淀物A；

⑸在所述沉淀物A中加入300~400μL、1 mol/L 的NaCl，待所述沉淀物溶解后再加入300~400 μL氯仿-异戊醇，轻轻混匀至不分层，然后在温度为4℃的条件下以10000~12000 r/min的速率离心5 min，得到上清液B；

⑹在300~400μL所述上清液B中依次加入30~40μL、1 mol/L 的NaCl和800~900 μL预冷无水乙醇，冰浴静置5~10 min，然后在温度为4℃的条件下以10000~12000 r/min的速率离心5 min，得到沉淀物B；